Chapitre I – Les peptides membranotropes
1. Séquence peptidique de départ et établissement de nouvelles séquences peptidiques par
séquences peptidiques par prédiction d’activité : passage d’une activité
antimicrobienne à une activité pénétrante ?
Il existe des milliers de peptides membranotropes dont font parties les peptides antimicrobiens et les peptides pénétrants, et la diversité de leurs séquences ne permet pas d’établir une règle générale concernant une relation séquence-activité. Pourtant, des outils de classification appelés séparateurs à vaste marge (ou machine à vecteurs de support) ont été développés pour prédire l’activité de ces peptides [205, 206, 207]. Ces machines sont des classificateurs linéaires associés à un algorithme et souvent à une base de données qui vont permettre de classer des séquences peptidiques en une à deux catégories selon une analyse par régression. Dans le cas des peptides interagissant avec les membranes, les paramètres sur lesquels les prédictions sont habituellement basées sont la charge globale du peptide, sa composition en acides aminés, l’ordre de ces acides aminés dans la séquence et leurs propriétés physico-chimiques (hydrophobie, point isoélectrique …). À ces paramètres, peuvent s’ajouter des critères de sélection de séquences tels que la parenté physico-chimique ou l’homologie de séquence avec un peptide déjà recensé. De manière générale, la prédiction obtenue en utilisant ces machines est strictement qualitative et concerne seulement des séquences sans modifications avec les extrémités N-terminale et C-terminale libres.
La première idée de cette étude a été d’utiliser ces outils de prédiction pour essayer d’obtenir, à partir de la séquence d’un peptide antibactérien, de nouveaux peptides avec une activité pénétrante. La séquence d’origine est celle de la dermaseptine DMS-DA5 « GMWGKIKSTAKEAAKAAGKAALNAVSEAL », un peptide antibactérien isolé de la rainette arboricole Pachymedusa dacnicolor [57], qui a été précédemment étudié au laboratoire et a montré une activité antibactérienne particulièrement efficace sur les bactéries à Gram négatif. Il a été décidé de commencer l’étude sur de courtes séquences de dix acides aminés
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consécutifs retrouvés dans la séquence de DMS-DA5. La base de données Collection of Anti-Microbial Peptides (ou CAMPR3) possède un séparateur à vastes marges qui permet de calculer la probabilité que la séquence soit celle d’un peptide antimicrobien ou non [208]. De manière intéressante, il apparait que seules la séquence DMS-DA5 et celle des trois premiers peptides de dix acides aminés générées à partir de l’extrémité N-terminale possèdent une forte probabilité de porter une activité antimicrobienne selon cette première prédiction (Tableau 3).
Position Séquence Prédiction Probabilité AMP
1-29 GMWGKIKSTAKEAAKAAGKAALNAVSEAL AMP 0,873 1-10 GMWGKIKSTA AMP 0,948 2-11 MWGKIKSTAK AMP 0,911 3-12 WGKIKSTAKE AMP 0,829 4-13 GKIKSTAKEA Non-AMP 0,248 5-14 KIKSTAKEAA Non-AMP 0,111 6-15 IKSTAKEAAK Non-AMP 0,241 7-16 KSTAKEAAKA Non-AMP 0,020 8-17 STAKEAAKAA Non-AMP 0,010 9-18 TAKEAAKAAG Non-AMP 0,025 10-19 AKEAAKAAGK Non-AMP 0,064 11-20 KEAAKAAGKA Non-AMP 0,013 12-21 EAAKAAGKAA Non-AMP 0,007 13-22 AAKAAGKAAL Non-AMP 0,000 14-23 AKAAGKAALN Non-AMP 0,001 15-24 KAAGKAALNA Non-AMP 0,000 16-25 AAGKAALNAV Non-AMP 0,005 17-26 AGKAALNAVS Non-AMP 0,009 18-27 GKAALNAVSE Non-AMP 0,001 19-28 KAALNAVSEA Non-AMP 0,009 20-29 AALNAVSEAL Non-AMP 0,009
Tableau 3. Prédiction de l’activité antimicrobienne de DMS-DA5 et des peptides issus de sa séquence en utilisant CAMPR3. La probabilité AMP est comprise entre 0 et 1 (plus le nombre est proche de 1, plus il est probable que le peptide soit antimicrobien) [208].
D’autre part, la capacité à pénétrer les membranes des peptides issus de ces mêmes séquences a également été évaluée avec le séparateur à vastes marges de CellPPD [209]. Selon ces premières prédictions, le peptide DMS-DA5 n’est pas pénétrant (Tableau 4). Parmi les séquences à dix acides aminés, seules trois semblent présenter le caractère pénétrant et elles
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présentent toutes une charge globale supérieure aux séquences prédites comme ne présentant pas cette activité. En effet, les peptides prédits comme étant pénétrants possèdent tous au moins trois acides aminés chargés positivement (lysine) sur les dix de la séquence, résultant en une charge globale de +3 ou +2 selon la présence ou non d’un acide aminé chargé négativement (acide glutamique). Parmi les peptides prédits qui possèdent une charge globale de +2, seuls ceux qui possèdent un acide aminé basique en position terminale, dans ce cas une lysine, sont prédits avec le caractère pénétrant. La position N-terminale libre est une fonction amine chargée positivement à pH physiologique. Une lysine en N-terminal génère donc deux charges positives à cette position, ce qui favorise les interactions électrostatiques entre le peptide et les phospholipides anioniques des membranes (Tableau 4) [210, 211].
Position Séquence Prédiction Charge
1-29 GMWGKIKSTAKEAAKAAGKAALNAVSEAL Non-CPP + 3 1-10 GMWGKIKSTA Non-CPP + 2 2-11 MWGKIKSTAK CPP + 3 3-12 WGKIKSTAKE Non-CPP + 2 4-13 GKIKSTAKEA Non-CPP + 2 5-14 KIKSTAKEAA Non-CPP + 2 6-15 IKSTAKEAAK Non-CPP + 2 7-16 KSTAKEAAKA CPP + 2 8-17 STAKEAAKAA Non-CPP + 1 9-18 TAKEAAKAAG Non-CPP + 1 10-19 AKEAAKAAGK Non-CPP + 2 11-20 KEAAKAAGKA CPP + 2 12-21 EAAKAAGKAA Non-CPP + 1 13-22 AAKAAGKAAL Non-CPP + 2 14-23 AKAAGKAALN Non-CPP + 2 15-24 KAAGKAALNA Non-CPP + 2 16-25 AAGKAALNAV Non-CPP + 1 17-26 AGKAALNAVS Non-CPP + 1 18-27 GKAALNAVSE Non-CPP 0 19-28 KAALNAVSEA Non-CPP 0 20-29 AALNAVSEAL Non-CPP - 1
Tableau 4. Prédiction de l’activité pénétrante de DMS-DA5 et des peptides de dix acides aminés issus de sa séquence en utilisant CellPPD [209].
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La séquence « MWGKIKSTAK » semble ainsi posséder les deux activités, antimicrobienne et pénétrante, et a été choisie comme point de départ pour cette étude en tant que peptide nommé « DA5m-S1-01 » (« DA5m » correspondant à « DA5 modifié » ou « DA5 mutant », et « S1 » correspondant à Série 1 : les peptides de séquences similaires seront classés par série avec « 01 » le numéro du peptide au sein de la série). Malgré la prédiction de CellPPD, la capacité à pénétrer de DA5m-S1-01 est mise en doute par un autre outil de prédiction CPPpred [212]. En effet, cette nouvelle prédiction montre que le peptide DA5M-S1-01 serait encore moins capable de pénétrer les cellules que DMS-DA5, montrant respectivement des scores de 0,393 et 0,558. De plus, ces deux séquences présentent des scores très faibles lorsque l’on les compare au score de la pénétratine, CPP présenté précédemment, qui possède un score élevé de 0,762 (Tableau 5) [59, 78, 89].
Nom Séquence Score CPPpred
Pénétratine RQIKIWFQNRRMKWKK 0,762
DMS-DA5 GMWGKIKSTAKEAAKAAGKAALNAVSEAL 0,558
DA5m-S1-01 MWGKIKSTAK 0,393
Tableau 5. Prédiction de l’activité pénétrante de la pénétratine, de DMS-DA5 et DA5M-S1-01 en utilisant CPPpred. Le score CPPpred est compris entre 0 et 1, et correspond à la probabilité que le peptide possède la capacité de pénétrer les cellules (plus le nombre est proche de 1, plus il est probable que le peptide soit pénétrant). Le score de la pénétratine a été calculé pour obtenir un score de référence pour l’activité pénétrante [212].
D’autre part, de nombreuses études ont montré l’importance de la nature de l’acide aminé portant la charge positive sur la capacité d’un peptide à interagir avec les membranes et en particulier sa capacité à pénétrer les cellules [213, 214]. Par exemple, Nakase et ses collaborateurs ont montré qu’il est possible de transformer un peptide antimicrobien en peptide pénétrant par la substitution de lysines par des arginines [215]. Ce changement de nature de l’acide aminé est en analogie avec le fait que les charges positives sont apportées généralement plutôt par des lysines dans les séquences des AMP et par des arginines dans celles des CPP [66, 67]. J’ai alors réalisé cette substitution sur chacune des trois lysines dans la séquence de DA5m-S1-01, ce qui donne respectivement les séquences « MWGRIKSTAK », « MWGKIRSTAK » et « MWGKIKSTAR » qui ont été ensuite analysées par CPPpred (Tableau 6).
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Séquence Score CPPpred
MWGRIKSTAK (DA5m-S1-02) 0,451
MWGKIRSTAK 0,449
MWGKIKSTAR 0,439
MWGKIKSTAK (DA5m-S1-01) 0,393
Tableau 6. Prédiction de l’activité pénétrante de DA5m-S1-01 et de ses dérivés présentant une substitution d’une lysine par une arginine en utilisant CPPpred. La substitution de l’acide aminé dans la séquence est représentée en rouge [212].
Les trois séquences possèdent des scores similaires et la séquence « MWGRIKSTAK », où la lysine la plus proche de l’extrémité N-terminale a été substituée en arginine et ayant présenté le score le plus élevé parmi les trois séquences, a été choisie en tant que deuxième peptide, DA5m-S1-02, à étudier et à comparer avec DA5m-S1-01.
Comme précédemment, selon CPPpred, les scores de probabilité du caractère pénétrant de DA5m-S1-01 et DA5m-S1-02 sont relativement faibles comparés à celui de la pénétratine qui est toujours utilisée en tant que référence (Tableau 5). Des prédictions ont donc été réalisées par CellPPD sur toutes les séquences par substitution d’un seul acide aminé dans celle de DA5m-S1-01 (Tableau 7). Une fois encore, les peptides qui ont la plus forte probabilité d’être pénétrants sont ceux qui présentent une charge globale élevée (généralement à partir de trois charges positives sur les dix acides aminés).
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Position de la mutation Séquence Prédiction Charge
DA5m-S1-01 MWGKIKSTAK CPP + 3 1 DWGKIKSTAK Non-CPP + 2 2 MEGKIKSTAK Non-CPP + 2 2 MNGKIKSTAK CPP + 3 5 MWGKRKSTAK CPP + 3 5 MWGKSKSTAK CPP + 3 1 EWGKIKSTAK Non-CPP + 2 1 NWGKIKSTAK CPP + 3 1 QWGKIKSTAK CPP + 3 3 MWDKIKSTAK CPP + 2 5 MWGKTKSTAK CPP + 3 8 MWGKIKSKAK CPP + 4 9 MWGKIKSTDK CPP + 2 9 MWGKIKSTNK CPP + 3 9 MWGKIKSTQK CPP + 3 3 MWEKIKSTAK Non-CPP + 2 3 MWNKIKSTAK CPP + 3 3 MWQKIKSTAK CPP + 3 5 MWGKPKSTAK CPP + 3 7 MWGKIKKTAK CPP + 4
Tableau 7. Prédiction de l’activité pénétrante de peptides possibles par substitution d’un seul acide aminé dans la séquence de DA5m-S1-01 en utilisant CellPPD. Les modifications dans la séquence sont représentées en rouge [209].
Parmi toutes les séquences ainsi obtenues, celles qui ont été prédites comme étant « CPP » ont été ensuite analysées par CPPpred (Tableau 8). En concordance avec les prédictions de CellPPD et comme vu précédemment, les peptides présentant la plus grande probabilité d’être pénétrants sont ceux qui portent la plus grande charge globale positive. Ces peptides sont logiquement ceux qui sont issus d’une substitution d’un acide aminé neutre ou chargé négativement par un acide aminé basique tel que l’arginine ou la lysine dans la séquence de DA5m-S1-01. Ces prédictions suggèrent que la capacité à pénétrer dans les cellules serait directement liée à la charge globale du peptide et pourrait être induite ou améliorée en augmentant cette dernière.
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Séquence Score CPPpred
MWGKIKSTAK 0,393 MWGKRKSTAK 0,672 MWGKIKRTAK 0,649 MWGKKKSTAK 0,618 MWRKIKSTAK 0,599 MWGKIKKTAK 0,597 RWGKIKSTAK 0,583 MWGKLKSTAK 0,583 MWGKWKSTAK 0,570 MWGKIKLTAK 0,558 MWGKVKSTAK 0,554
Tableau 8. Prédiction de l’activité pénétrante de DA5m-S1-01 et des dix séquences issues de la substitution d’un seul acide aminé dans sa séquence qui présentent les meilleurs scores CPPpred. Le score CPPpred est compris entre 0 et 1, et correspond à la probabilité que le peptide possède la capacité à pénétrer les cellules (plus le nombre est proche de 1, plus il est probable que le peptide soit pénétrant). Les modifications dans la séquence sont représentées en rouge [212].
La séquence « MWGKRKSTAK » est celle qui possède la plus haute probabilité de correspondre à un peptide pénétrant parmi ces séquences à dix acides aminés bien que son score en utilisant CPPpred ne soit pas aussi élevé que celui de la pénétratine. Cette séquence a donc été sélectionnée en tant que peptide DA5m-S1-03.
Parmi les séquences présentant un score similaire à celui de DA5m-S1-03 (Tableau 8), la séquence « MWGKIKRTAK » a été retenue en tant que peptide DA5m-S1-04. Son score concernant l’activité antimicrobienne sur CAMPR3 est supérieur à celui de DA5m-S1-03 et similaire à celui de DA5m-S1-01 (0,911) (Tableau 9).
Nom Séquence Prédiction Probabilité AMP
DA5m-S1-03 MWGKRKSTAK AMP 0,773
DA5m-S1-04 MWGKIKRTAK AMP 0,925
Tableau 9. Prédiction de l’activité antibactérienne de DA5M-S1-03 et DA5M-S2-01 en utilisant CAMPR3. La probabilité AMP est comprise entre 0 et 1 (plus le nombre est proche de 1, plus il est probable que le peptide soit antimicrobien) [208].
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De plus, la représentation de Schiffer-Edmundson (en considérant que les deux peptides sont structurés en hélice α) suggère que DA5m-S1-04 est plus amphiphile que DA5m-S1-03, dans la mesure où le cinquième résidu, une arginine dans le cas de DA5m-S1-03 et une isoleucine dans le cas de DA5m-S1-04, se trouvent du côté hydrophobe de l’hélice (Figure 44). En effet, l’arginine en position 5 apporte une charge positive sur la face hydrophobe de l’hélice dans le cas de DA5m-S1-03. La comparaison de ces deux peptides nous permettra de vérifier l’importance de l’amphiphilie.
Figure 44. Projection en roue hélicoïdale des peptides DA5m-S1-03 (à gauche) et DA5m-S1-04 (à droite). Les acides aminés basiques hydrophiles sont représentés des pentagones. Les acides aminés hydrophobes sont représentés par des losanges.
[http://rzlab.ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi].
Tous les peptides prédits (DA5m-S1-01, DA5m-S1-02, DA5m-S1-03 et DA5m-S1-04) sont synthétisés par synthèse peptidique manuelle sur résine MBHA en tant que support solide. Cette résine permet aux peptides de présenter une amidation en extrémité C-terminale. De plus, quatre glycines supplémentaires et une biotine ont été ajoutées à leur extrémité N-terminale. Cette modification est nécessaire pour vérifier et quantifier l’internalisation de ces peptides dans les cellules [216, 217]. Cependant, l’effet de l’ajout de la biotine et des quatre glycines en extrémité N-terminale n’a pas pu être analysé par les machines de prédiction et a été directement étudié par la suite dans les tests biologiques.
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L’activité antibactérienne de ces mêmes peptides est alors évaluée sur deux souches de bactéries à Gram négatif (Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa) et deux souches à Gram positif (Staphylococcus aureus et Kocuria rhizophila) (Tableau 10). Ces souches ont été sélectionnées pour leur caractère pathogène, étant des sources d’infections nosocomiales. En particulier, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus font toutes deux partie des bactéries ESKAPE. Comme mentionné précédemment, les bactéries de cette catégorie s’adaptent de manière remarquable aux antibiotiques et présentent donc une menace particulièrement préoccupante en santé publique [218].
Souche bactérienne
Gram négatif Escherichia coli ATCC 8739Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Gram positif Staphylococcus aureus ATCC 6538
Kokuria rhizophilaATCC 9341
Tableau 10. Liste des souches bactériennes testées.
L’activité antimicrobienne d’un peptide sur une souche bactérienne est caractérisée par une concentration minimale inhibitrice, ou CMI, qui correspond à la plus faible concentration de peptide qui inhibe totalement la croissance bactérienne. Les résultats de ce chapitre sont résumés sous forme de tableau, les courbes des tests antimicrobiens qui ne figurent pas dans le texte peuvent être retrouvées en annexe.
Des tests précédemment réalisés avec le peptide DMS-DA5 ont permis de montrer que ce peptide a une activité antibactérienne particulièrement efficace contre les bactéries à Gram négatif. Afin de pouvoir comparer les activités antibactériennes des nouveaux peptides avec DMS-DA5, nous avons repris les tests antibactériens sur les quatre souches bactériennes listées en tableau 10 (Figure 45).
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Figure 45. Tests antibactériens de DMS-DA5 sur les bactéries E. coli, P. aeruginosa,
K. rhizophila et S. aureus. Les barres d’erreur sont basées sur les écart-types entre les
différentes expériences (trois expériences en triplicata). La concentration minimale inhibitrice est déterminée par le point d’intersection de la courbe avec l’axe des abscisses.
Nous retrouvons que le peptide DMS-DA5 est particulièrement efficace contre la bactérie à Gram négatif Escherichia coli avec une concentration minimale inhibitrice de 1,6 µM. Le peptide arrive également à inhiber la croissance des trois autres souches bactériennes mais à des concentrations plus élevées (supérieures à 10 µM).