Influence du nombre d’acides aminés : pair ou impair ?

En cherchant la cause de l’absence d’activité antibactérienne des peptides raccourcis, nous avons également vérifié si les peptides raccourcis adoptent une structure en hélice α en présence de lipides comme de nombreuses dermaseptines dont le peptide DMS-DA5 d’origine [52-55]. Nous avons donc simulé avec le programme PEP-FOLD 2.0 la structure des peptides DMS-DA5, DA5m-S2-01 et DA5m-S2-02. Ce programme permet une prédiction empirique de la structure la plus probable que peut adopter un peptide linéaire de 9 à 36 acides aminés

0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0,2 0,4 0,8 1,6 3,1 6,25 12,5 25 50 100 C roissan ce b act ér ien n e

Concentration en peptides (en µM)

DA5m-S2-02N / S. aureus DA5m-S2-02B / S. aureus

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lorsque celui-ci se structure dans un environnement mimant les membranes et fournit un résultat sous la forme d’un modèle tridimensionnel du peptide [224]. Ces premiers modèles confirment la structure en hélice α du peptide DMS-DA5 et révèlent également que les peptides DA5m-S2-01 et DA5m-S2-02 ne sont plus strictement hélicoïdaux mais qu’ils forment un coude β dans leur région N-terminale (Figure 51).

Figure 51. Représentation en ruban des peptides DMS-DA5 (A), S2-01 (B) et DA5m-S2-02 (C). Les structures secondaires sont représentées par le code couleur : désordonnée en blanc, hélice α en rose et coude β en cyan. Les modèles obtenus sont visualisés grâce au logiciel Visual Molecular Dynamics (VMD) [225].

Cette perte de la structure en hélice α a pour conséquence la perte du caractère amphiphile du peptide. La représentation qui colore la surface tridimensionnelle du peptide en fonction du caractère hydrophile/hydrophobe des acides aminés montre que DA5 se présente comme une hélice parfaitement amphiphile. En revanche, les peptides DA5m-S2-01 et DA5m-S2-02 sont partiellement repliés du côté N-terminal et la partie hydrophobe de ces peptides se retrouve confinée entre les parties hydrophiles du peptide, en rendant impossibles les interactions hydrophobes entre les chaines latérales hydrophobes du peptide et les chaines carbonées des phospholipides membranaires (Figure 52). Cette partie

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hydrophobe comprend le tryptophane qui est nécessaire pour initier l’insertion dans les membranes chez de nombreux peptides. Cela permettrait d’expliquer pourquoi ce repliement du peptide nuirait à l’insertion du peptide dans les membranes.

Figure 52. Représentation de la surface tridimensionnelle des peptides DMS-DA5 (A), DA5m-S2-01 (B) et DA5m-S2-02 (C). L’hydrophilie et l’hydrophobie sont représentées par le code couleur : hydrophile en bleu et hydrophobe en rouge. Les modèles obtenus sont visualisés grâce au logiciel Visual Molecular Dynamics (VMD) [225].

Cependant, ce ne sont que des modèles et la structure tridimensionnelle de ces peptides doit être confirmée par analyse structurale par dichroïsme circulaire qui sera détaillée vers la fin du chapitre.

Les séquences de nombreuses dermaseptines montrent plusieurs motifs qui sont très conservés tels que le tryptophane en 3ème position et les enchainements d’alanines et de lysines tels que « AAKAA » ou « GKAA » (Tableau 14). Nous avons donc essayé d’insérer ces motifs dans les séquences des peptides suivants afin de pouvoir éventuellement induire une activité antibactérienne et/ou une structure en hélice α.

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Peptide Animal Séquence Référence

DMS-DA5 ^Pachymedusa

dacnicolor ^GMWGKIKSTAKE----AAKAAGKAALNAVSEAL _[57]

Dermaseptin DA4 ^Pachymedusa

dacnicolor GMWSKIKNAGKAAKAAAKAAGKAALGAVSEAM [55]

Dermaseptin AA-3-6 ^Agalychnis

annae ^GMWSTIRNVGKS----AAKAANLPAKAALGAISEAV _[46] ARP-AC1 ^Agalychnis callidryas ^GMWSKIKEAGKAAAKAAAKAAGKAALDVVSGAIG _[226] Dermaseptin-PD-1 ^Pachymedusa dacnicolor ^GMWSKIKETAMAAAKEAAKAAGKTISDMIKQ _[227] Dermaseptin-PD-2 ^Pachymedusa dacnicolor ^GMWSKIKNAGKAAAKAAAKAAGKAADAVSEAI [227] Dermaseptin-J7 ^Phasmahyla jandaia ^GLWSKIKAAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAV [228] Dermaseptin-H6 ^Phyllomedusa azurea ^GLWSTIKQKGKEAAIAAAKAAGQAAL [229] Dermaseptin DRG1 ^Phyllomedusa bicolor ^GLWSNIKTAGKE----AAKAALKAAGKAALGAVTDAV [230] Dermadistinctin-K ^Phyllomedusa distincta ^GLWSKIKAAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAV _[231] Dermaseptin-4 ^Phyllomedusa hypochondrialis ^GLWSTIKQKGKEAAIAAAKAAGKAVLNAASEAL _[232] Dermaseptin-5 ^Phyllomedusa hypochondrialis ^GLWSTIKQKGKEAAIAAAKAAGQAALGAL _[232] Dermaseptin-6 ^Phyllomedusa hypochondrialis ^GLWSTIKQKGKEAAIAAAKAAGQAVLNSASEAL _[232] Dermaseptin-7 ^Phyllomedusa hypochondrialis ^GLWSTIKQKGKEAAIAAAKAAGQAALNAASEAL [232]

Dermaseptin sVI ^Phyllomedusa

sauvagei ^GLWSKIKTAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAI [233]

Dermaseptin-5 ^Phyllomedusa

sauvagei ^GLWSKIKTAGKSVAKAAAKAAVKAVTNAV [234]

Dermaseptin-1 ^Phyllomedusa

tarsius ^GLWSKIKETGKE----AAKAAGKAALNKIAEAV [235]

Tableau 14. Séquence de plusieurs dermaseptines répertoriées dans la littérature mettant en évidence les motifs conservés. Les acides aminés conservés sont indiqués en rouge (tryptophane en 3ème position dans la séquence) et en gras (motif « AAKAA »).

Les séquences des peptides de la suite de l’étude ont été établies à partir de la séquence DA5m-S3-00 « GMWGKIKSTAKEAAKAA» qui est le segment 1 à 17 de la séquence de DMS-DA5. Cette séquence permet d’incorporer les deux caractéristiques mentionnées précédemment : un tryptophane en 3ème position dans la séquence et le motif « AAKAA ».

Après de multiples prédictions de structure d’abord par PEP-FOLD (Figure 53) [224] puis confirmation par d’autres machines de prédiction tel que MeDor (Figure 54) [236], la modification de la séquence de DA5m-S3-00 a permis d’établir celle de DA5m-S3-01

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« GMWGKIKTAKEAAKAA » qui présente les meilleures probabilités de posséder une structure en hélice α.

Figure 53. Représentation en ruban des peptides DA5m-S3-00 « GMWGKIKSTAKEAAKAA » (à gauche) et DA5m-S3-01 « GMWGKIKTAKEAAKAA » (à droite). Les structures secondaires sont représentées par le code couleur : désordonnée en blanc, hélice α en rose et coude β en cyan. Les modèles obtenus sont visualisés grâce au logiciel Visual Molecular Dynamics (VMD) [225].

Figure 54. Prédictions des structures des peptides DA5m-S3-00 « GMWGKIKSTAKEAAKAA » (à gauche) et DA5m-S3-01 « GMWGKIKTAKEAAKAA » (à droite) par le logiciel MeDor. L’hélice rouge au-dessus de la séquence représente la partie du peptide qui se structure en hélice α selon les prédictions [236].

La séquence de DA5m-S3-01 obtenue est alors modifiée pour promouvoir l’activité pénétrante puisque le logiciel CPPpred lui attribue un score inférieur à 0,5 (Tableau 11). Les prédictions encouragent une nouvelle fois l’augmentation de la charge globale. La modification de séquence ne se limite cette fois qu’à la substitution d’un seul acide aminé et implique principalement la substitution de l’acide glutamique dans la séquence de DA5M-S3-01 par un acide aminé neutre ou chargé positivement. Ainsi, les séquences des peptides DA5M-S3-02 « GMWGKIKTAKLAAKAA » et DA5M-S3-03 « GMWGKIKTAKRAAKAA »

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sont alors générées (tableau 15). Ces peptides sont potentiellement antimicrobiens et structurés en hélice α mais possèdent une charge globale différente. Cela pourrait permettre de déterminer la charge globale minimale nécessaire à l’activité pénétrante.

Nom Séquence ^Score

CAMPR3 Score CPPpred ^Charge DMS-DA5 GMWGKIKSTAKEAAKAAGKAALNAVSEAL 0,873 0,558 + 3 DA5m-S3-01 GMWGKIK-TAKEAAKAA 0,956 0,499 + 2 DA5m-S3-02 GMWGKIK-TAKLAAKAA 0,988 0,601 + 3 DA5m-S3-03 GMWGKIK-TAKRAAKAA 0,963 0,661 + 4

Tableau 15. Séquence des peptides DA5m-S3-01, DA5m-S3-02 et DA5m-S3-03 inspirées de DMS-DA5. La substitution dans la séquence de DA5M-S3-01 pour induire le caractère pénétrant est indiquée en rouge. Les Scores sont compris entre 0 et 1 (plus le nombre est proche de 1, plus il est probable que le peptide aie l’activité correspondant) [208, 212].

Cependant, aucun de ces nouveaux peptides ne présentent d’activité antibactérienne contre les quatre souches testées (Tableau 16, Figure 55 et Annexes 93 à 95).

Peptide Séquence

Test AMP (CMI)

E. coli ^P. aeruginosa K. rhizophila S. aureus

Insertion du motif dermaseptine "AAKAA" pour retrouver l'hélice α

DA5m-S3-01N GMWGKIKTAKEAAKAA Non Non Non Non

DA5m-S3-01B BGGGGGMWGKIKTAKEAAKAA Non Non Non Non

DA5m-S3-02N GMWGKIKTAKLAAKAA Non Non Non Non

DA5m-S3-02B BGGGGGMWGKIKTAKLAAKAA Non Non Non Non

DA5m-S3-03N ^GMWGKIKTAKRAAKAA Non Non Non Non

DA5m-S3-03B BGGGGGMWGKIKTAKRAAKAA Non Non Non Non

Tableau 16. Résultats des tests antibactériens avec les peptides DA5m-S3 sur les quatre souches testées. Les « B » dans les séquences correspondent à la biotine. Tests réalisés trois fois en triplicata.

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Figure 55. Tests antibactériens des peptides DA5m-S3 sur E. coli. Les courbes correspondant au peptide sans modification de l’extrémité N-terminale sont en trait plein (______) et celles correspondant au peptide biotinylé en traits discontinus (- - -). Tests réalisés en triplicata trois fois.

Au moment où les résultats sur les tests antibactériens en utilisant ces peptides DA5m-S3 ont été obtenus, Guzmàn et ses collaborateurs ont montré que les peptides possédant un nombre pair d’acide aminés n’étaient pas aussi actifs contre les bactéries que les peptides qui possèdent un nombre impair d’acides aminés. En utilisant des polylysines de différentes tailles, ils ont observé que seuls les peptides possédant un nombre impair de lysines présentent une CMI inférieure ou égale à 10 µM contre les bactéries [237, 238]. En prenant en compte les résultats déjà obtenus et cette information, la taille des séquences établies ultérieurement est alors fixée à 15 acides aminés.