Les cellules rénales humaines (HK-2), et les cellules épithéliales bronchiques humaines WI (26VA4), ont été obtenues chez ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA).
3.2 Produits utilisés en culture cellulaire
Les milieux de croissance utilisés pour les cultures cellulaires sont les suivants:
- le milieu de croissance appelé « RPMI » ('Roswell Park memorial Institute', milieu 1640 contenant des sels organiques, des acides aminés, des vitamines, du D- glucose, du glutathion, du phénol et du bicarbonate de sodium avec L-Glutamine et 24 mM d’HEPES) est utilisé pour les cellules épithéliales bronchiques WI,
- le milieu Eagle’s minimum essential medium (D-MEM avec 1000mg/l de D glucose et complémenté par 2µM de glutamine) pour les cellules rénales HK2. Ces milieux ainsi que le tampon phosphate salin (PBS), et la trypsine ont été obtenus chez Invitrogen Life-Technologies (Cergy Pontoise, France). Le tampon PBS est constitué de KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8 g/l, Na2HPO4 1,15 g/l, pH 7,4. La solution de trypsine est
constituée de Trypsine (0,05%)-EDTA (0.53 mM).
Le milieu nutritif est supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal apportant des facteurs mitogènes nécessaires à la division cellulaire et par 1% d'antibiotiques (streptomycine et pénicilline) fournis par Life-Technologies (Cergy Pontoise, France). Les consommables proviennent du laboratoire Becton Dickinson. Le diméthyl sulfoxide (DMSO) provient de chez Sigma (France).
3.3 Conditions de culture
3.3.1 Maintien des constantes physico-chimiques
Les cellules sont cultivées dans des flasques de 75 cm2, contenant 10 ml de milieu de culture supplémenté en sérum de veau feotal (SVF) et antibiotiques, à 37 °C dans une atmosphère humide et saturée à 5% CO2 dans une étuve stérile. Le système tampon utilisé est
le bicarbonate (HCO3-) en équilibre avec le C02 de l'étuve, permettant de maintenir un pH de
7,4. Dans le milieu de culture est inclus un indicateur de pH : le rouge de bromophénol virant au violet ou au jaune pour des pH respectivement, alcalins ou acides.
3.3.2 Mise en culture d'une lignée cellulaire
Les souches cellulaires sont conservées dans de l’azote liquide dans 1 ml d’une solution de congélation (1 ml de milieu de culture contenant 10 % de DMSO, 40 % de sérum de veau fœtal).
Sorti de l’azote liquide, le tube reste 1 min à température ambiante avant d’être porté à 37 °C, 1 min dans un bain-marie. Dix ml de milieu de culture supplémenté (10 % de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine), préalablement chauffé à 37 °C, est versé dans une flasque de 75 cm2 avec 1 ml de la culture de cellule décongelée. Une nuit à 37 °C permet l’adhésion des cellules au support. Au bout de trois jours, les cellules ne pouvant plus se développer correctement due à l'épuisement du milieu de culture, il est nécessaire d'effectuer un passage ou repiquage pour maintenir la viabilité des cellules et l'état de culture. Cette opération permet l’amplification de la culture cellulaire.
3.3.3 Amplification d’une lignée cellulaire
Cette étape consiste à réduire le nombre de cellules contenues dans les boites, afin de leur permettre de poursuivre leur développement correctement. Pour les cellules HK2, le
75 repiquage est effectué à 80% de confluence. Le milieu de culture est aspiré et la flasque est
rincée à deux reprises avec du PBS. Ceci a pour but d’éliminer les traces de SVF, inhibiteur de la trypsine. Un ml de trypsine pour les cellules HK-2 et à ½ ml de trypsine dilué avec le même volume d’eau pour les cellules WI, préalablement chauffée à 37°C, est ajouté dans chaque flasque afin de décoller le tapis cellulaire. La flasque est placée à 37°C pour favoriser l’activité enzymatique de la trypsine. Quand la dissociation du tapis cellulaire est visible à l’oeil nu, la trypsination est stoppée par addition dans la flasque de 5ml de milieu de culture complet. Le surnageant, contenant les cellules, est récupéré et centrifugé 10 minutes, à 1400 rpm, à 4 °C. Les cellules culottées sont remises en suspension dans la quantité de milieu nécessaire à l'obtention d'une solution de 106 cellules/ml environ. La suspension cellulaire obtenue est répartie dans différents flacons, à raison de 1ml par boite, auxquels sont ajoutés 10 millilitres de milieu de culture.
3.3.4 Mise en conservation d'une culture cellulaire
Les cellules à confluence d’une flasque sont décollées par trypsination (addition d’un millilitre de trypsine pour les cellules HK-2 et de 1 ml de trypsine ½ pour les cellules WI); elles sont culottées par centrifugation 11 minutes, à 4°C, 2400 rpm, puis le culot est remis en suspension dans 1 ml de milieu de congélation.
Le milieu de congélation est composé comme suit : il s’agit de milieu de culture, sans antibiotiques, supplémenté avec 10% DMSO et 40% SVF pour les cellules HK-2 et WI 26. Le ml de milieu de congélation, contenant les cellules, est disposé dans des tubes cryogéniques NALGENE, et est placé une nuit à –80°C dans une boite de cryocongélation puis est mis dans l’azote liquide.
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3.4 Conditions de traitement des cellules
Quel que soit le type cellulaire, les traitements ont été effectués avec un milieu supplémenté avec 5 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine.
Il est nécessaire de réaliser au préalable une amplification des cellules afin de disposer d'un nombre suffisant de flasques pour les traitements.
Les cellules sont traitées par des solutions de toxines diluées dans du milieu de culture stérile non supplémenté en SVF.
Chaque traitement est réalisé en triplicata ainsi qu'un témoin négatif correspondant à des cellules recevant uniquement la solution de dilution des toxines. Pour chacune des flasques, le milieu de culture est aspiré et un lavage au PBS durant une minute est effectué. On rajoute ensuite 10 ml de milieu de culture puis les doses de mycotoxines sont directement introduites dans la flasque. L'incubation est réalisée à l'étuve à 37oC selon un temps prédéfini.