Cette première étape consiste à casser les membranes du tissu afin de libérer l’ADN des noyaux. L’extraction se fait à froid dans de la glace pour limiter l’activité des DNAses cellulaires et ainsi préserver l’intégrité de l’ADN.
6.1.1 A partir de tissus
Environ un demi-gramme d’organe est écrasé dans 400μl de SET* à l’aide d’un homogénéisateur. Le récipient est rincé avec du SET. On ajoute 200μL de SDS à 10%. Le mélange est porté dix minutes à 65°C puis placé dans la glace pendant trente minutes.
Les cellules en suspension, ou le broyat d’organe sont centrifugés pendant 25 minutes à 13 000 rpm à 15°C dans un centrifugeuse Sigma1K-15. Le surnageant contenant l’ADN et l’ARN est récupéré dans un tube de 15 ml. On ajoute 2 volumes d'éthanol (≈ 4 ml) pur, froid (-20°C) et on agite vivement : les pelotes d'ADN apparaissent. Les tubes sont placés une nuit au -20°C. Les filaments d'ADN sont récupérés à la pipette ou par centrifugation 1,5 ml par 1,5 ml dans un tube conique de 2ml. Les pelotes sont centrifugées 25 minutes, à 13 000 rpm, à 0°C, dans une centrifugeuse Sigma 1K-15. Le surnageant est délicatement éliminer pour ne pas perdre le culot d’ADN. L’ADN est lavé avec 1 ml d'éthanol à 90 %, froid puis centrifugé 15 minutes, à 13000rpm, à 0°C dans une centrifugeuse Sigma 1K-15. Le surnagent est éliminé, et les acides nucléiques sont dissous dans 500μl de SET. Pour faciliter la dissolution une incubation à 37°C pendant 15 minutes est réalisée.
* Pour 250 ml de SET mélanger : 5 ml de NaCl de 5M, 12.5 ml EDTA 0.4M, 6.25 ml TRIS 2M. Ajuster le pH à 8 avec NaOH 5M Compléter avec de l'eau miliQ qsp 250 ml volume final.
6.1.2 A partir du sang
Un ml de sang est agité en présence d’un gramme de billes en verre et 2 ml de SET pendant 1 minute. Le mélange est centrifugé 5minutes à 13000rpm, à 0°C, (Sigma 1K-15)., afin de pouvoir enlever les billes. Le mélange est incubé dix minutes à 65°C en présence de 300μL de SDS à 20%. Puis, les protéines sont précipitées par ajout de 2400 µl d’Acétate de potassium (6 M, pH 5) pendant 30 min dans la glace. L’échantillon est ensuite centrifugé à 0 °C, 25 min à 13000 rpm (Sigma 1K-15). Les acides nucléiques sont récupérés et lavés comme indiqué au paragraphe précédent.
6.1.3 A partir des cellules
Trois boites de cellules, correspondant au même type de traitement, sont plongées dans un bac de glace pour figer l’état cellulaire et éviter la dégradation de l’ADN. Le tapis cellulaire est gratté deux fois avec des grattoirs dans 4 ml de SET. Les fractions contenant les cellules des trois boites sont récoltées dans un tube de 50 ml. Elles sont centrifugées 30 min à 4°C à 6 000 g. Le surnageant est mis de côté et conservé à -20°C. Le culot est lavé avec 4 ml de SET dans les mêmes conditions que précédemment décrites pendant 10 min. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans 800 µl de SET à 4°C et transvasé dans un micro-tube de 2 ml.
Cent µl de SDS à 20 % sont ajoutés à l’échantillon et incubés pendant 10 min à 65 °C pour casser les membranes. Puis, les protéines sont précipitées par ajout de 800 µl d’Acétate de potassium (6 M, pH 5) pendant 30 min dans la glace. L’échantillon est ensuite centrifugé à 0 °C, 25 min à 13000 rpm (Sigma 1K-15). Les acides nucléiques sont récupérés comme décrit dans les paragraphes précédents.
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6.2 Purification et dosage de l'ADN
L’ARN est éliminé par l’action de RNases. Dans un premier temps le mélange de RNase A à 20mg/ml, et de RNAse T1 à 10000 UI/ml est dissous dans de l’eau ultrapure. Le mélange est mis à bouillir à 100°C pendant 15 minutes pour détruire les DNases. Dix μl de ce mélange sont ajoutés à l’échantillon d’ADN à purifier. Au bout d’une heure d’incubation à 37°C, on rajoute 10μl du mélange de RNases. L’ensemble est incubé une heure supplémentaire à 37°C. Pour détruire les protéines, 25 μl de Protéinase K à 20 mg/ml dissous dans du SET sont ajoutés au mélange qui est incubé une heure à 37°C.
La purification de l’ADN se poursuit par ajout de 500μl (1 Volume) de Rotiphénol (phénol saturé en tris pH 8). Le mélange est agité mécaniquement pendant 20 min. Le mélange est centrifugé à 13000rpm pendant 15 min à 15°C (Sigma 1K-15). Le surnageant est récupéré dans des microtubes. On renouvelle l’extraction comme précédemment, lors d’une extraction de l’ADN à partir des organes. Cinq cent μl de SEVAG (24 Chloroforme / 1 Alcool isoamylique) sont ajoutés au surnageant. On agite 20 Secondes puis on centrifuge 5 minutes à 15000rpm (Sigma 1K-15). Le surnageant, qui doit être limpide, est récupéré.
Deux volumes d’éthanol froid pur (-20°C) et 50μl d’acétate de sodium 3M sont ajoutés. Les pelotes apparaissent immédiatement. Laisser 1 nuit au –20°C. L’ADN est récupéré comme précédemment.
6.3 Estimation de la qualité et de la quantité d'ADN
Les solutions d’ADN sont mises 15 minutes au bain marie 37°C avant lecture au spectrophotomètre (Secomam, Anthelie advanced 5) afin d’avoir une solution homogène. L’intégralité de l’échantillon est transférée dans des cuves en quartz de 1 ml de contenance. La pureté et la quantité d’ADN en solution sont évaluées en faisant un spectre entre 220 et 320 nm. Le maximum d’absorption de la molécule d’ADN se situe entre 258 et 260 nm. Au delà de cet intervalle, un déplacement du maxima d’absorption vers 250 nm ou 280 nm indique une contamination de l’ADN par de l’ARN, ou par des protéines respectivement. Par conséquent sa purification doit être refaite à partir de cette solution.
La quantité d’ADN de l’échantillon est calculée en considérant que 1 unité d’absorbance équivaut à 50 µg/ml. Des aliquotes contenant 4 µg d’ADN sont préparés à partir de la solution mère d’ADN et sont ensuite séchés à l’aide d’une centrifugeuse à évaporation sous vide (« Speedvac concentrator » de Savant). A partir de cette étape, l’aliquote d’ADN est prêt à être marqué.
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