Titration d’ASP2 libre en solution

2.5.1.1 Protocole exp´erimental

Le tube qui a servi `a la titration en pH contient 550µl d’une solution `a 0,3 mM d’ASP2 marqu´ee 15N fraˆıchement dissoute, 50mM NaN₃ et 10% de D2O. Dans ces conditions, le pH

2.5. Effet du pH : ASP2 libre est en ´equilibre entre deux formes au-dessus de pH 6,6. 147 r´esidu δ_HN(ppm) δ_N(ppm) 94 8,12 114,4 95 8,40 121,5 96 8,85 117,8 98 7,74 119,0 99 7,88 115,4

Tab. 2.2: Attribution des r´esidus N94 `a N99 d’ASP2 dans la forme libre.

Fig. 2.10: Superposition des spectres ¹⁵ N-HSQC entre pH 8-8,5 et pH 6,1 `a 308K (du noir vers le magenta). Les r´esidus d´edoubl´es sont attribu´es en noir. Les d´eplacements importants sont suivis par une fl`eche. En rouge, les r´esidus dont la r´esonance est fortement d´eplac´ee entre pH 6,6 et 6,1.

Fig. 2.11: Superposition des spectres ¹⁵ N-HSQC `a pH 6,1 (noir), 5,7 (vert), 4,3 (bleu) et 3,5 (magenta).

est ´equilibr´e entre 8 et 8,5. J’ai ajust´e le pH ensuite par ajout successif d’une solution environ molaire d’acide chlorhydrique. J’ai ainsi balay´e le pH entre environ 8 et 3,5 : 8-8,5 ; 7-7,5+; 7-7,5⁻; 6,5-7+;6,5-7⁻; 6,6 ; 6,1 ; 5,7 ; 4,3 et 3,5. Jusqu’`a pH 6,6, le pH a ´et´e mesur´e par papier pH, en-dessous, le pH a ´et´e mesur´e par un pH-m`etre calibr´e entre 4 et 7. Le papier pH est moins pr´ecis que le pH-m`etre, ce qui explique les intervalles de valeurs pour les pH sup´erieurs `

a 6,6. L’exposant+ (resp.⁻) indique que le pH est dans la gamme sup´erieure (resp. inf´erieure) de l’intervalle. Pour chaque pH, j’ai accumul´e un spectre ¹⁵N-HSQC et un spectre Watergate filtr´e15N pour ´eliminer les r´esonances amides.

2.5.1.2 Analyse des spectres HSQC et 1d Watergate filtr´ee 15N .

L’attribution de la prot´eine libre a ´et´e effectu´ee par une NOESY-HSQC ´edit´ee 15N . La plupart des r´esonances peuvent ˆetre attribu´ees sur la base de l’attribution d´ej`a men´ee sur le

.

Fig. 2.12: Titration en pH suivie par des spectres 1d Wa-tergate filtr´ee ¹⁵N dans la r´ e-gion des aromatiques et des m´ethyles de la valine V78 (`a droite).

Fig. 2.13: Titration en pH au-dessus de 6,6. La variation de d´eplacement chimique du squelette est cod´ee par la couleur : du bleu au rouge, les d´ e-placements sont de plus en plus importants. Les chaˆınes lat´erales de H79 et F122 sont en orange.

Fig. 2.14: Deux environnements en ´echange lent. Les r´esidus pour lesquels au minimum deux r´esonances amides ont ´et´e observ´ees sont en rouge. En bleu, les chaˆınes lat´erales pr´esentes sous deux formes (Q3, V78, Y113, Y117 et F122). En vert, le pont disulfure C96-C116.

2.5. Effet du pH : ASP2 libre est en ´equilibre entre deux formes au-dessus de pH 6,6. 149

Fig. 2.15: A gauche, titration en pH des protons amides des r´esidus Y67, G102 et E106 entre pH 8-8,5 et 6,1. A droite, d´eplacement de la r´esonance de K101 entre pH 8-8,5 et 3,5. Les trois valeurs de pH marquent les points caract´eristiques de la titration.

complexe ASP2/TSP. Il faut pr´eciser que les segments 94-99 et 114-118 subissent une forte variation de d´eplacement chimique entre la forme libre `a pH 7-8 et en complexe avec le TSP : les d´eplacements chimiques des r´esidus 94 `a 99 de la forme libre sont tabul´es (tableau 2.2). L’isoleucine I97 n’a pu ˆetre attribu´ee.

Au-dessus de pH 6,1 Lorsque la prot´eine est solubilis´ee (pH 8-8,5), la carte HSQC montre un d´edoublement de certaines r´esonances (par exemple, Y67, G102, E106, voir figure 2.15) avec une forme majoritaire et une forme minoritaire. Les r´esidus G48 et L50 sont repr´esent´es par trois ou quatre r´esonances. Les r´esonances des deux formes des r´egions E95-C96 et C116-Y117-I118 de la prot´eine sont relativement ´eloign´ees les unes des autres (reli´es par les traits sur le spectre HSQC). La diff´erence de fr´equences de r´esonance des deux composantes des autres r´esidus est inf´erieure `a 20Hz. De mˆeme, les protons H_ de la tyrosine Y117, les protons δ de la ph´enylalanine 122 et le m´ethyle γ₂ de la valine V78 sont en ´echange lent entre deux formes (figure 2.12). Du fait de la superposition au centre de la r´egion des aromatiques, le comportement des autres aromatiques n’a pu ˆetre suivi. La distribution des sites en ´equilibre lent entre deux ´etats est illustr´ee sur la structure d’ASP2 (figure 2.14).

En baissant le pH, deux ph´enom`enes ont lieu. Une cinquantaine de r´esonances se d´eplacent plus ou moins fortement (figures 2.10 et 2.13) du fait d’une titration de pKas. Les raies des r´esidus K101 et E102 sont les plus fortement d´eplac´ees. ´Etonnamment, l’intensit´e des deux formes en ´echange s’inverse : la forme minoritaire devient majoritaire. Cela se voit sur les r´esonances des chaˆınes lat´erales de V78 et Y117, ainsi que sur les protons amides de Y67, G102, E106 (figure 2.15), M60, A100 et D105. A un pH d’environ 7, les deux formes sont pr´esentes avec la mˆeme intensit´e tandis qu’`a pH 6,1, une seule r´esonance subsiste pour tous les r´esidus, y compris la glycine G48 et L50. Cette transition est visible ´egalement sur les chaˆınes lat´erales.

Entre pH 7 et pH 6,1, un certain nombre de r´esonances sont singuli`erement d´eplac´ees (en rouge sur la figure 2.10). La plupart sont insensibles au pH et, bien qu’il soit possible qu’`a ce pH, nous titrions un pKa plus faible, il est plus probable que ce d´eplacement soit en r´ealit´e l’apparition de la forme minoritaire au d´etriment de la forme majoritaire.

Nous pouvons donc conclure qu’`a un pH sup´erieur `a 7, deux formes d’ASP2 existent en solution, en ´echange lent : une forme B (pour basique) et une forme A (pour acide). A pH

6,1, nous sommes en pr´esence d’une forme unique A pour tous les r´esidus, forme minoritaire `a haut pH. Les plus fortes diff´erences de d´eplacements chimiques entre les formes sont localis´ees sur la structure : la zone contenant le plus de d´edoublement concerne le segment peptidique reliant les deux cyst´eines C96 (h´elice α5) et C116 (h´elice α6) impliqu´ee toutes deux dans le mˆeme pont disulfure.

Nous notons ´egalement le d´eplacement avec le pH de la r´esonance du proton H_ de l’histi-dine H79. La gamme de pH dans laquelle nous nous situons correspond au pKa attendu d’une histidine (6-7). Si la fr´equence de r´esonance de ce proton se d´eplace, c’est que nous observons vraisemblablement la protonation progressive d’un des azotes du cycle aromatique de cette histidine.

Au-dessous de pH 6 J’ai mesur´e trois points de pH en dessous de pH 6,1 : 5,7, 4,73 et 3,5 (figure 2.11). A pH 3,5, la dispersion des r´esonances est plus faible. La prot´eine subit sans doute une transition vers un ´etat “molten-globule” dans lequel la structure est partiellement d´enatur´ee. Une partie des r´esidus peut ˆetre attribu´ee en suivant les r´esonances. Cependant, leur distribution non localis´ee sur la structure ne permet pas de d´efinir une r´egion de la structure se d´epliant avant une autre.

Entre pH 6,1 et 4,5, il est fort probable que les groupes acides des aspartates et glutamates soient titr´es, comme le montre entre autre le d´eplacement, `a partir de pH 6,1, de G81, Y67, E106, K112 et Y113, proches spatialement respectivement de D85, E65 et E98, E103 et E106, D115. Le cas de la lysine K101 est int´eressant. La figure 2.15 montre que le mouvement de la r´esonance associ´ee `a K101 n’est pas continu. Il semble donc que le point d’inflexion `a pH 6,1 traduit la pr´esence de deux groupes acido-basiques de pKas diff´erents dans l’environnement de la lysine. Il s’agit probablement des lysines K112 ou K101 et des glutamates E65 ou E103. La d´enaturation partielle est r´eversible Durant cinq jours, la solution est rest´ee `a pH 3,5. J’ai ensuite v´erifi´e la stabilit´e de la prot´eine en remontant le pH `a 5,8. Le spectre 15N -HSQC est alors compl`etement retrouv´e. La d´enaturation partielle est donc r´eversible. En ajustant `a nouveau le pH `a 7,5, le d´edoublement des raies r´eapparaˆıt. A pH 12,4, une partie des r´esonances disparaˆıt `a cause de l’augmentation de la vitesse d’´echange entre les protons amides et les protons aqueux. Cependant, les deux formes A et B sont toujours en ´equilibre lent : les r´esonances associ´es aux acides amin´es G48, I58, Y67, I92 entre autres, sont d´edoubl´ees. Sur toute la gamme de pH, on constate que la r´esonance du proton H26<sub></sub> est fixe avec le pH, mˆeme dans l’´etat de molten-globule. Cela sugg`ere que le groupe imidazole de ce r´esidu n’est pas affect´e par la d´enaturation partielle de la structure et confirme donc l’absence de nOe et son orientation vers le solvant.

2.5.1.3 Discussion

Au-dessus de pH 6,6, le suivi de la titration en pH des r´esonances est d´elicat du fait de l’h´et´erog´en´eit´e d’ASP2 libre. Plusieurs raies sont d´edoubl´ees et par cons´equent, la d´ etermi-nation de tout pKa est impossible. C’est le cas en particulier pour la lysine 101 et la glycine 102. Il aurait ´et´e int´eressant de d´eterminer le pKa titr´e car il est fort probable que le groupe acido-basique `a l’origine de ces titrations est sans doute le mˆeme pour ces deux r´esidus.

2.5. Effet du pH : ASP2 libre est en ´equilibre entre deux formes au-dessus de pH 6,6. 151 Le passage `a une solution tr`es acide (pH 3,5) d´enature partiellement la structure (molten-globule). Certaines structures secondaires, voire tertiaires, sont conserv´ees comme le sugg`ere la dispersion des raies dans la carte15N -HSQC. Cependant, le repliement global de la prot´eine est affect´e comme le montre le spectre des aromatiques, o`u les r´esonances sont tr`es resserr´ees. Ce r´esultat confirme les spectres de dichro¨ısme circulaire effectu´es `a pH 3 par l’´equipe de l’INRA et qui concluaient `a une augmentation de la flexibilit´e des chaˆınes lat´erales.

Le cycle en pH indique que la d´enaturation partielle est r´eversible ainsi que la reformation de la forme B. Il ne peut donc s’agir dans notre cas d’un exemple d’hyst´er´esis en pH.

Mais le r´esultat le plus important de cette exp´erience est la mise en ´evidence d’un ´equilibre lent d’ASP2 `a pH basique entre deux formes A et B, dont les populations respectives d´ependent du pH. De par les points de pH ´echantillonn´es, le pH exact de transition n’a pu ˆetre d´etermin´e. Il est compris entre 6,1 et 6,6. Les spectres tr`es similaires de ces deux formes sugg`erent que les modifications `a l’origine de la s´eparation n’ont qu’un effet tr`es faible sur la structure d’ASP2. Cependant, la r´egion localis´ee autour du pont disulfure semble ˆetre importante. A priori, l’observation d’une telle h´et´erog´en´eit´e peut ˆetre dˆu `a plusieurs facteurs : ´equilibre monom`ere-dim`ere o`u les h´elices α<sub>5</sub> et α<sub>6</sub> constitueraient l’interface du dim`ere, ´equilibre entre deux conformations stables de la prot´eine (isom´erisation d’un pont disulfure, changement d’orientation d’une chaˆıne lat´erale,. . . ). Cela m’a motiv´e `a entreprendre une caract´erisation des deux formes. Ce sera l’objet du chapitre 4.

Quelques soucis de reproductibilit´e Ces diff´erents r´esultats sont `a nuancer. Durant la dur´ee de ma th`ese, j’ai pr´epar´e plusieurs ´echantillons d’ASP2 sans TSP. La d´ependance en pH telle que relat´ee ici n’a pu ˆetre reproduite. Quel que soit le pH, la forme B est rest´ee majoritaire alors que la forme A est en g´en´eral observ´ee. Les hypoth`eses de l’existence d’un cycle d’hyst´er´esis ou d’un effet de la concentration en prot´eine sont exclues. Une explication possible est une h´et´erog´en´eit´e entre les lots d’origine, due par exemple `a des concentrations en sel diff´erentes. En effet, certains lots avaient un aspect cristallin tandis que d’autres ´etaient sous la forme d’une poudre fine.

D’autre part, les r´esidus dont les r´esonances sont pr´esentes en double ne sont pas toujours les mˆemes d’un ´echantillon `a un autre. Cependant, j’ai not´e un d´edoublement syst´ematique des r´esidus marqu´es en rouge sur la figure 2.13. Dans certains ´echantillons, les r´esonances correspondant aux acides amin´es L14, A22, I58, Y67 sont apparues d´edoubl´ees.