Deux exp´ eriences h´ et´ eronucl´ eaires tridimensionnelles : CBCANH et

2.1.2.1 La CBCANH

Nous nous contenterons de d´etailler une seule s´equence se terminant par l’acquisition de l’hydrog`ene amide : la CBCANH (Grzesiek and Bax [1992a]). Les autres du mˆeme type fonc-tionnent sur les mˆemes principes spectroscopiques.

La s´equence d’impulsions de la CBCANH que j’ai utilis´ee est repr´esent´ee dans la figure 2.4. Les rectangles ´etroits et larges sont respectivement des impulsions 90^◦ et 180^◦. Toutes les impulsions sur le canal carbone sont s´electives (gaussiennes). La fr´equence du canal est centr´ee au milieu des carbones aliphatiques. Les impulsions sur le carbonyle sont hors r´esonance. Le second pulse 90^◦ sur les carbones aliphatiques (marqu´e sp8) a un profil sym´etrique par rapport au premier. Nous pouvons isoler 5 ´etapes dans ce chemin de coh´erence qui part des hydrog`enes H<sub>α</sub>− H<sub>β</sub> pour finir `a l’acquisition sur les hydrog`enes amides :

a `a b Transfert INEPT des hydrog`enes aliphatiques vers leurs carbones par le couplage sca-laire ¹J_HC ' 140Hz . En b, l’aimantation se trouve suivant H_zC_x

b `a c Temps constant T_C : ´edition du d´eplacement chimique des carbones C_α et C_β, d´ ecou-plage de¹J_CaliC0 et¹J_CaliN , transfert de l’aimantation H_zC_x^β vers H_zC_y^βC_z^α, refocalisation H_zC_x → C_y pendant le d´elai 2τ_e = _2J ¹

HCali. En c, les aimantations int´eressantes sont sui-vant les coh´erences Cβ

yCα z et Cα

x

c `a d Passage des ´etats Cβ yCα z et Cα x vers Cβ zCα y et Cα x

d `a e Transfert de l’aimantation vers les azotes des r´esidus i et i+1 avec d´ecouplage de1J_HC et refocalisation du terme Cβ

zCα

y vers un ´etat pur Cα

x. En e, l’aimantation est suivant C_yN_zⁱ et C_yN_zⁱ⁺¹.

e `a f Les ´etats pr´ec´edents sont transform´es en : C_zNi

y et C_zNi+1 y .

Fig. 2.2: Strat´egie d’attribution d’un prot´eine marqu´ee¹⁵N-¹³C bas´ee sur exp´eriences tridimension-nelles `a base de transfert de coh´erence. Les boˆıtes noires encadrant un syst`eme de spins indique la connectivit´e ´etablie dans les exp´eriences respectives. La partie grise de la boˆıte signifie que le spin est utilis´e comme relais, sans ´edition du d´eplacement chimique. L’attribution s´equentielle des r´esonances du squelette est obtenue par la combinaison des exp´eriences a). L’attribution est am´elior´ee par la combinaison des Cαet des Cβ(b). Les syst`emes de spin (H,C) identifi´es dans une HCCH-TOCSY sont reli´es aux r´esonances (H,N) du squelette en utilisant les d´eplacements chimiques des H_α,β et C_α,β des spectres HCCH-TOCSY et CBCA(CO)NH ou HBHA(CO)NH (reproduction de Sattler et al. [1999]).

f `a g Temps constant TN : ´edition du d´eplacement chimique de l’azote, d´ecouplage de ¹JN C0

et de 1J_{N Cα}, cr´eation d’un terme H_zN_y en antiphase. En g, l’aimantation est suivant Ni

yHi

z et Ni+1 y Hi+1

z . g `a h Passage des ´etats Ni

yHi z et Ni+1 y Hi+1 z vers Ni zHi y et Ni+1 z Hi+1 y

h `a i Refocalisation vers un ´etat en phase H_y, suppression du solvant par watergate

Temps constant T_C Nous allons d´etailler le premier temps constant T_C. Entre les instants b et c, plusieurs termes d’interaction de couplage scalaire ne commutent pas avec la coh´erence H_zC_x, ils peuvent donc a priori modifier cette coh´erence. La construction du temps constant a pour but d’en ´eliminer les effets, ou au contraire de les conserver. Leur effet d´epend de la dur´ee totale pendant laquelle ils vont s’exercer. Il s’agit donc de calculer cette dur´ee sachant qu’une impulsion 180^◦ a pour effet d’inverser le signe de l’interaction scalaire si elle n’affecte qu’un seul des noyaux. Les lignes suivantes montrent la dur´ee totale d’´evolution de chacun des termes d’interaction ne commutant pas avec H_zC_x : Cali

z H_z, Cali z N_z, Cali z C_z⁰, Cα zCβ z et Cali z .

2.1. Attribution du squelette peptidique. 63

Fig. 2.3: Tableau des d´eplacements chimiques des noyaux de chaque type d’acide amin´e, attendus dans une structuration en pelote statistique ou random coil. (Cavanagh et al. [1996])

Fig. 2.4: S´equence d’impulsion de la 3D-CBCANH. La suppression de l’eau est assur´ee par une Watergate. Le cyclage de phase sur 16 phases est le suivant : Φ2 = y; Φ3 = x, −x; Φ4 = 8x, −8x; Φ5 = 2x, −2x; Φ6 = −2y, 2y; Φ7 = −y; Φ8 = 4x, −4x; Φ9 = −x, −y; Φrecepteur = x, −x, −x, x, x, −x, −x, x, −x, x, x, −x, −, x, x, −x. Les pulses non marqu´es sont suivant x. Les gra-dients G1 et G2 sont fix´es `a 10% et 20%, respectivement suivant les axes x et z. Les d´elais sont choisis `

a : δ1 = _4J¹

HC = 1, 7ms ; δ2 = 11ms ; T_C = 3, 6ms ; τe = 1, 1ms ; T_N = 12, 4ms ; _2J¹

HN = 5, 5ms . Le mode d’acquisition est en TPPI dans les deux dimensions indirectes (phases Φ₃ et Φ₅)

1JC_aliH : ^t1 2 ^{+ τe}− TC+ τe+ TC−^t1 2 ^{= 2τe (2.1)} 1J_CaliN : ^t1 2 − τ_e− T_C+ τ_e+ T_C−^t1 2 ^{= 0 (2.2)} 1JC_aliC0 : ^t1 2 − τe− TC+ τe+ TC−^t1 2 ^{= 0 (2.3)} 1J_CαCβ : ^t1 2 ^{+ τe+ TC}− τ_e+ T_C−^t1 2 ^{= 2TC (2.4)} C_z^ali: ^t1 2 ^{+ τe+ TC}− τe− TC+^t1 2 ^{= t1 (2.5)}

Les interactions scalaires du carbone aliphatique vers l’azote et le carbonyle ont une dur´ee ´

equivalente d’application nulle (lignes 2.2 et 2.3), ces termes seront refocalis´es et ils n’au-ront pas d’effet sur l’´evolution de la coh´erence H_zC_x. Le terme d’interaction Cali

z H_z s’exerce pendant 2τ_e (ligne 2.1). Le d´elai 2τ_e est ajust´e `a _2J¹

CH pour transf´erer l’aimantation vers un ´

etat purement carbone. L’exp´erience n’´etant pas de type aller-retour, ce transfert permet de d’´eliminer l’hydrog`ene de la coh´erence.

La ligne 2.4 met en ´evidence l’´evolution de la coh´erence de d´epart suivant le couplage entre les carbones aliphatiques. Ce transfert dˆu au couplage scalaire de 35Hz est indispensable pour observer au final un signal modul´e par le d´eplacement chimique du C_β. Le lecteur attentif remarquera qu’il y a des pertes : de C_α vers Cβx par le couplage entre les deux carbones et, ´

eventuellement de Cβxvers les C_γpar couplage scalaire. Les coh´erences qui vont ˆetre conserv´ees apr`es l’instant c seront Cα

x et Cβ yCα

2.1. Attribution du squelette peptidique. 65 Le dernier terme d’interaction (ligne 2.5) correspond au d´eplacement chimique des car-bones, qui module la coh´erence de d´epart par un facteur cos(2πω_Ct₁), ω_C correspondant au d´eplacement chimique soit du C_α, soit du C_β.

La seconde impulsion sur le carbonyle a pour fonction d’´eliminer l’erreur de phase induite par l’effet Bloch-Siegert (Sattler et al. [1999]) par la premi`ere impulsion sur l’aimantation transverse C_α/C_β.

Transfert carbone vers azote et refocalisation du terme C_y^βC_z^α Les constantes de couplage scalaire intra- et interr´esiduels entre les carbones C_α et N ont des valeurs comprises respectivement dans les intervalles 1J_Ci

αNi = 9 − 12.5Hz et 1J_Ci

αNi+1 = 6 − 9Hz. D’autre part, ¹JCαC_β = 35 − 40Hz. Avec δ2 = 11ms, les transferts Cⁱ → Ni et Cⁱ → Ni+1 sont optimis´es et le terme Cβ

yCα

z est refocalis´e vers un terme purement Cα

z. En e, l’aimantation est Cα

zNi z + Cα

zNi+1

z , quel que soit l’hydrog`ene d’origine.

Temps constant T_N L’analyse du second temps constant T_N est analogue au pr´ec´edent. Le couplage N C⁰ est refocalis´e sans effort (ligne 2.8) tandis que le terme en antiphase vis-`a-vis du carbone est refocalis´e grˆace au couplage N C<sub>α</sub> appliqu´e durant 2T<sub>N</sub> (ligne 2.7) : la dur´ee totale de ce temps constant est de 24.8ms. Le d´ecouplage en protons durant la premi`ere partie du temps constant d´etruit le terme de couplage scalaire HN . Il ne s’exprime que pendant _2J¹

HN. Cela permet de cr´eer en g la coh´erence en anti-phase H_zN_x. Comme attendu, le d´eplacement chimique de l’azote s’exprime durant t₂.

1JN H : 0 + ¹ 2JHN = ¹ 2JHN (2.6) 1JN C_α : ^t2 2 ^{+ TN + TN}− ¹ 2J_HN −^t2 2 ⁺ 1 2J_HN ^{= 2TN (2.7)} 1J_{N C}0 : ^t2 2 − T_N + T_N− ¹ 2J_HN −^t2 2 ⁺ 1 2J_HN ^{= 0 (2.8)} N_z: ^t2 2 ^{+ TN} − TN+ ¹ 2JHN +^t2 2 ⁺ 1 2JHN = t₂ (2.9)

Acquisition Le signal acquis est de la forme :

S(t) = A1cos 2πδC_αit1
cos (2πδNit2) cos^2πδ_Hi Nt3



H_αⁱ − C_αⁱ − Nⁱ− H_Nⁱ +A₂cos 2πδ_C

αit₁
cos (2πδNi+1t₂) cos^2πδ_Hi+1 N

t₃^ H_αⁱ − C_αⁱ − Nⁱ⁺¹− H_Nⁱ⁺¹ +A₃cos^2πδ_C

βit₁^cos (2πδ_Nit₂) cos^2πδ_Hi

Nt₃^ H_βⁱ − Ci

β− Ni− Hi N

+A₄cos^2πδ_C

βit₁^cos (2πδ_Ni+1t₂) cos^2πδ_Hi+1 N

t₃^ H_βⁱ − Ci

β− Ni+1− Hi+1 N

Les coefficients A contiennent les fonctions trigonom´etriques associ´ees au chemin de coh´ e-rence marqu´e `a droite et diff`erent en fonction du type d’acide amin´e impliqu´e. Apr`es trans-form´ee de Fourier tridimensionnelle, chaque bande extraite aux d´eplacements chimiques d’un couple H_N − N contient quatre taches de corr´elation correspondant aux carbones C_α et C_β intrar´esiduels et interr´esiduels (en i-1). Les r´esonances C_α de glycine et tous les C_β sont de signe oppos´e aux C_α des autres r´esidus. Cette exp´erience est relativement peu sensible (25 fois

Fig. 2.5: S´equence d’impulsions COCAH. Les rectangles larges (resp. ´etroits) repr´esentent des impulsions 180^◦ (resp. 90^◦). Toutes les impulsions sur les canaux carbones sont s´electives (pro-fil gaussien). Par d´efaut, les impulsions sont de phase x. Le cyclage de phases est le suivant : φ₁ = x, y ;φ₂ = 8x, 8(−x) ;φ₃ = 2x, 2y ;φ₄ = 4y, 2(−y) ;φ₅ = 2y, 2(−y),φ_acq = x, 2(−x), x. Les d´ e-lais sont fix´es `a : T = 4, 6ms, ∆ = 4, 5ms, T⁰ = 3, 5ms, ∆⁰ = 3, 4ms, τ = 1, 6ms,τ⁰ = 1, 1ms. La s´election des coh´erences est effectu´ee par la m´ethode echo-antiecho sur les gradients 2 et 4.

moins que la HNCO, Sattler et al. [1999]) du fait de la r´epartition de l’aimantation initiale de l’hydrog`ene sur les carbones de deux r´esidus.

2.1.2.2 Exp´erience COCAH

L’exp´erience COCAH permet de corr´eler les r´esonances C⁰,C_α et H_α d’un mˆeme r´esidu. La s´equence d’impulsions est repr´esent´e sur la figure 2.5. Elle est bas´ee sur la s´equence publi´ee par Dijkstra (Dijkstra et al. [1994]). Je l’ai am´elior´ee en utilisant des gradients pour nettoyer les coh´erences non voulues et s´electionner le transfert carbone vers hydrog`ene tout en ´eliminant le signal du solvant.

Sch´ematiquement, cette s´equence commence sur le carbonyle. Le temps constant qui suit ´

edite le d´eplacement chimique du carbonyle tout en d´ecouplant en proton et en azote et en laissant le couplage C⁰-C_α s’exprimer. Au point a, l’aimantation est sur C_x⁰Cα

z. Apr`es les deux impulsions π/2 sur le carbone, l’aimantation est sur C_z⁰C_x^α. Durant le second temps constant (jusqu’en b), l’aimantation est modul´ee par le d´eplacement chimique de C_α et ´evolue sous les couplages C⁰C_α et C_αH_α. En b, l’aimantation est sur Cα

xHα

z. Le reste de la s´equence ram`ene l’aimantation sur l’hydrog`ene (INEPT retour) avant l’acquisition. Les deux temps constants commencent par des inversions pour compenser l’effet Bloch-Siegert.

Outre les corr´elations du squelette, cette exp´erience corr`ele ´egalement les noyaux H_ali-C_ali -C⁰ des r´esidus Asp, Asn, Glu et Gln.