La mod´ elisation par Aria

3.2.1.1 Param´etrisation d’ARIA

Pour mettre en oeuvre un calcul d’ARIA, il faut tout d’abord cr´eer un fichier “new.html” qui d´efinit les liens vers les fichiers de contraintes, les listes de pics et les fichiers d’attribution de la prot´eine correspondant `a chaque exp´erience, ainsi que la tol´erance pour chaque dimension. Le lancement d’ARIA sur ce fichier cr´ee l’arborescence, transforme les fichiers d’entr´ee au format ARIA et cr´ee un fichier run.cns, qui contient toutes les informations sur la param´etrisation de la mod´elisation (recuit simul´e) et sur la proc´edure de l’attribution automatique.

J’ai utilis´e par d´efaut les param`etres contenus dans ce fichier. Cependant, j’ai modifi´e les ponts disulfure (C21-C53, C49-C107 et C96-C116). Le fichier de param`etres ´energ´etiques est “parallhdg5.3”.

J’ai utilis´e les trois listes de pics obtenus par peak-picking automatique dans NmrView sur les exp´eriences 3D de type NOESY ´edit´ees 15N et 13C et l’exp´erience bidimensionnelle dans D2O (pour les aromatiques). Pour le calcul de la matrice de relaxation, j’ai d´efini le champ (800MHz) et le temps de m´elange des exp´eriences. Le temps de corr´elation τ_c fut d’abord fix´e `

a 9ns. Puis, quand j’ai obtenu la valeur exp´erimentale par les exp´eriences de relaxation, j’ai utilis´e la valeur 4,87ns.

Lors des premiers calculs, je n’ai impos´e aucune attribution aux pics nOes. Les structures calcul´ees alors convergeaient tr`es mal. La raison principale ´etait un probl`eme de tol´erance trop faible associ´e `a une attribution trop peu pr´ecise. En effet, le d´eplacement chimique d’un noyau varie d’une exp´erience `a l’autre en fonction des param`etres exp´erimentaux (temp´erature, pH, r´esolution), de traitement (pr´ediction lin´eaire) et d’analyse (calibration) et varie ´egalement d’un pic `a l’autre dans une mˆeme exp´erience (quelques centi`emes de ppm pour le proton). Pour obtenir une attribution plus pr´ecise pour chaque exp´erience, j’ai donc attribu´e dans NmrView la plupart des pics non ambigus. A partir des attributions de nOe associ´e `a un hydrog`ene, NmrView fait la moyenne des d´eplacements chimiques de cet hydrog`ene. Dans une seconde ´etape, j’ai donc utilis´e les listes de pics partiellement attribu´ees et les fichiers d’attribution modifi´es par NmrView. Lorsque les fichiers d’attribution furent plus pr´ecis, j’ai diminu´e la tol´erance et utilis´e les listes sans attribution des nOes pr´e-impos´ees. La tol´erance sur les h´et´eronoyaux 15N et 13C est alors de 0,5ppm. La tol´erance sur les d´eplacements chimiques des protons d´epend de la r´esolution : 0,02ppm pour la dimensions d’acquisition et 0,03ppm pour les dimensions indirectes. Lorsque la structure a commenc´e `a converger, j’ai utilis´e comme structure de d´epart, une structure de la s´erie de calculs pr´ec´edente (/begin/aria template.pdb). En fin de processus, j’ai accumul´e un spectre NOESY ´edit´e 15N sur un tube d’ASP2 marqu´e 15N de pH 6 `a 308K et `a 283K. Quelques taches de corr´elation HN s’´etant d´eplac´ees, j’ai pu ajout´e quelques contraintes suppl´ementaires d´efinies par un encadrement de la distance fonction de l’intensit´e de la tache observ´ee.

En phase finale de calcul, j’ai utilis´e les contraintes attribu´ees par Aria de fa¸con non ambigu¨e (fichier unambig.tbl) pour relancer un calcul en mode donn´ees d´ej`a calibr´ees (already calibrated data), en partant d’une structure ´etendue. Ce fichier contient des d´efinitions de

3.2. Le repliement tridimensionnel d’ASP2 en complexe avec le TSP 165

Exp´erience Total Attribu´es Attribution Contraintes (unambig.tbl) ambigu¨e non ambigu¨e Total ambigu¨e non ambigu¨e 3D-NOESY-HSQC¹³C 2094 1964 (94%) 687 (35%) 1277 (65%) 1006 197 809 3D-NOESY-HSQC15N 1696 1623 (96%) 490 (30%) 1133 (70%) 1007 114 893

NOESY dans D2O 372 344 (93%) 105 (30%) 239 (70%) 163 9 154

Total 4162 3931 (95%) 1282 (33%) 2649 (67%) 2198 320 1878

Tab. 3.3: Statistiques de l’attribution des pics nOe par Aria. Les trois premi`eres colonnes contiennent les nombres de pics (total par exp´erience, attribu´e et type d’attribution). Les pourcentages sont rapport´es par rapport au nombre contenu dans la colonne pr´ec´edente. Les trois derni`eres colonnes rassemblent les statistiques sur les contraintes finales de distances.

Fig. 3.9: Nombre de contraintes des dis-tances (nOe) par r´esidu. En noir, les contraintes intrar´esiduelles, en cyan, les contraintes entre deux r´esidus s´epar´es par moins de 2 r´esidus, en rouge, les contraintes `a longue distance.

distances ambigu¨es (ADR). Dans ces conditions, Aria n’est qu’une interface par rapport `a CNS et n’interpr`ete aucunement les donn´ees. Un jeu de 100 structures a ´et´e g´en´er´e et j’ai conserv´e les 20 structures de plus basse ´energie. Le module Analysis d’Aria permet d’analyser les 20 structures en termes de violation de contraintes g´eom´etriques et exp´erimentales et fournit une structure moyenne minimis´ee afin de r´eduire les d´eviations des param`etres g´eom´etriques (angles, longueur de liaisons) par rapport `a une structure id´eale.

3.2.1.2 R´esultats de l’attribution des corr´elations nOe et des contraintes de dis-tances.

La grande majorit´e des pics obtenus par peak-picking sous NmrView ont pu ˆetre attribu´es par Aria, soit de mani`ere ambigu¨e, soit de mani`ere non ambigu¨e. Le tableau 3.3 rassemble les statistiques de l’attribution. Une moyenne de 95% des pics ont ´et´e attribu´es dans les fichiers .xpk (format NmrView). Les 5% restants non attribu´es correspondent `a des pics de tr`es faible intensit´e (qui peuvent alors ˆetre interpr´et´es comme du bruit exp´erimental) ou `a des pics associ´es `a la superposition de plusieurs taches de corr´elation (en particulier dans la r´egion des chaˆınes lat´erales de Glu, Gln, Lys,...). Dans cette derni`ere situation, le centre du pic intense peut n’ˆetre corr´el´e `a aucun couple de d´eplacement chimique d’hydrog`enes potentiels. Plus des deux tiers des pics attribu´es l’ont ´et´e de mani`ere non ambigu¨e (un seul couple d’hydrog`enes en interaction).

Les trois derni`eres colonnes du tableau 3.3 rassemblent les statistiques sur le fichier unam-big.tbl qui a servi pour le calcul final de la structure. Les contraintes d´efinies dans ce fichier sont environ deux fois moins nombreuses que le nombre de pics attribu´es. A cela deux raisons, la premi`ere ´etant la redondance des corr´elations nOe, en particulier dans l’exp´erience NOESY-HSQC 13C, la seconde ´etant que la partie des contraintes ambigu¨es (ADR) dont Aria n’a pu d´eterminer avec suffisamment de confiance l’attribution, n’a pas ´et´e utilis´ee (709 contraintes). Pr`es de 2200 contraintes ont donc servi `a la reconstruction finale d’ASP2. J’ai ajout´e `a ce fichier des contraintes suppl´ementaires dont les corr´elations nOe sont superpos´ees ou invisibles dans les cartes analys´ees par Aria. Elles concernent le segment 28-42. Je me suis bas´e sur une exp´erience NOESY-HSQC-<sup>15</sup>N `a 283K. A cette temp´erature, la s´eparation des corr´elations de la 15N -HSQC permet d’isoler des r´esidus (D30, I31 et I34, Q36) auparavant superpos´es avec d’autres corr´elations et certaines corr´elations apparaissent. Sur la base de la propension des r´esidus 29 `a 34 `a former une h´elice (Talos, intensit´e des corr´elation H_Nⁱ -H_Nⁱ⁻¹), j’en ai extrait la contrainte (H34

N-H31

α ). D’autre part, j’ai ajout´e les contraintes (H34 N-H35

γ12) et (H36 N-H37

β ). Par ailleurs, des corr´elations tr`es ambigu¨es impliquaient les protons amides des r´esidus D40 et G41 et une r´esonance `a 1,43ppm susceptible d’ˆetre l’un des m´ethyles des A37 et A38, et le proton amide de G41 vers une r´esonance `a 4,17ppm, susceptible d’ˆetre le proton H<sub>α</sub> des r´esidus A37, A38 ou K39 . Compte tenu de la propension de ce segment `a former une h´elice α, j’ai attribu´e ces nOe `a des corr´elations (i, i+3).

La figure 3.9 montre la distribution du nombre de contraintes impliquant chaque r´esidu : contraintes intrar´esiduelles, `a moyenne distance (H<sup>i</sup>-H<sup>j</sup>, avec |i − j| ≤ 3) et `a longue distance (|i − j| ≥ 4). Le nombre moyen de contraintes par r´esidu est de 32. La majorit´e des r´esidus sont impliqu´es dans des contraintes `a moyenne et longue distance ce qui traduit la bonne structuration globale de la prot´eine. Par contre, sur le segment 28-45, le nombre total de contraintes est beaucoup plus faible et aucune contrainte `a longue distance n’implique le segment 35-41. A l’oppos´e, les r´esidus L61, K62, I92 et L121 fournissent de tr`es nombreuses contraintes (plus de 75). Ces r´esidus seront donc importants pour le repliement de la structure. 3.2.1.3 Les 20 structures de plus basse ´energie : les violations de contraintes et

carte de Ramachandran.

Parmi les 20 structures de plus basse ´energie, seules 4 structures pr´esentent des violations de nOe sup´erieures `a 0, 5˚A (au maximum 4 violations par structure). 13 structures violent au moins une contrainte di`edrale au-dessus de 5^◦ (au maximum 5 contraintes de ce type sont viol´ees par structure). Sur les 20 structures de plus basse ´energie, analys´ees dans le r´epertoire analysis, il ressort que le nombre total de violations de contraintes de distances varie de 85 `a 123. Ces contraintes se r´epartissent entre les taches de corr´elation nOe (de 65 `a 107 violations) et les liaisons hydrog`enes (de 12 `a 23 violations par structure). 92% des contraintes viol´ees sur ces 20 structures correspondent `a des distances sup´erieures `a l’intervalle autoris´e (distance effective sup´erieure `a la borne sup´erieure de l’intervalle). Aucune de ces violations n’est sup´erieure `a 0,3˚A.

La m´ethode utilis´ee par Aria pour d´efinir les intervalles de distances est plus restrictive que celle utilisant les intervalles fort-moyen-faible. Par cons´equent, le nombre de violations, relativement important, n’est pas inqui´etant dans la mesure o`u on pourrait sans trop de risque ´

3.2. Le repliement tridimensionnel d’ASP2 en complexe avec le TSP 167

Type d’ angles angles angles longueur Interaction distance (nOe+ angles Total

´energie impropres de liaison di`edres de liaison Van der Waals liaison hydrog`enes) di`edres par structure

Contraintes g´eom´etriques Contraintes exp´erimentales

Minimum 6,1 48,4 604,5 3,45 65,35 8,2 2 744,8 Maximum 36,2 95,1 637,0 8,11 115,45 173,1 146,8 1045,9 Moyenne 11,8 61,8 616,7 5,13 83,8 37,1 17,9 834,1 rmsd moyen des violations 0,28 (^◦) 0,3411(^◦) 40,89 (^◦) 0,00164 (˚A) 0,029 (˚A) 0,93 (^◦) par structure

Tab. 3.4: R´esum´e des statistiques ´energ´etiques des 20 structures d’ASP2 de plus basse ´energie et des violations par type de contrainte.

Fig. 3.10: Carte de Ramachandran des 20 meilleures structures. Chaque acide amin´e des 20 structures est repr´esent´e par un point en fonction de ses angles φ et ψ. Les glycines sont repr´esent´es par une croix.

Le tableau 3.4 r´esume les statistiques sur l’´energie des 20 structures finales.

La carte de Ramachandran (figure 3.10) est une repr´esentation des angles di`edres des acides amin´es au sein d’une prot´eine. Trois zones se distinguent correspondant aux angles di`edres attendus dans les h´elices α (zone α), les structures en brin β (zone β) et les boucles (zone L). Le logiciel Molmol a d´efini ces trois zones `a partir de l’´etude de 378 structures cristallographiques obtenues `a haute r´esolution. La couleur des zones correspondent `a la densit´e des points : 80% (respectivement 95% et 98%) des r´esidus sont dans la zone verte (respectivement jaune et violette). A l’exception des glycines, la grande majorit´e des r´esidus (20*123=2460 r´esidus au total) sont dans les zones autoris´ees. On constate une tr`es forte densit´e dans la zone α, corollaire de la structure en α d’ASP2. Les r´esidus situ´es dans les zones non autoris´ees (en blanc) sont localis´ees sur la structure dans le segment 26 `a 45.

L’analyse par Procheck indique que 80% des r´esidus d’ASP2 sont dans la r´egion centrale, 17,8% dans la r´egion acceptable (jaune) et 1,67% dans la r´egion acceptable ´etendue. 0,5% des r´esidus sont situ´es hors des zones acceptables.

Segment Atomes ´ecart quadratique moyen 1-23, 49-123 bb 0,71˚A

1-23, 49-123 heavy 1,09˚A 24-48 bb 2,46˚A

Tab. 3.5: Valeurs des ´ecarts quadra-tiques moyens de diff´erentes s´elections d’atomes (bb : squelette, heavy : h´et´ e-roatomes ) sur l’ensemble des 20 struc-tures.