3.2 Le repliement tridimensionnel d’ASP2 en complexe avec le TSP
3.2.2 La structure d’ASP2 en complexe avec le TSP
3.2.2.1 Un ensemble de 20 structures
Les 20 structures de plus basse ´energie sont repr´esent´ees sur la figure 3.11. A l’exception, du segment 24-48, la structure est tr`es bien d´efinie avec un ´ecart quadratique moyen de 0,71˚A sur les atomes du squelette. Compte tenu de l’absence de contraintes `a longue distance engageant les hydrog`enes du segment 34 `a 45, celui-ci est tr`es mal d´efini et son orientation par rapport au coeur structur´e de la prot´eine ne peut ˆetre pr´ecis´ee. La figure 3.12 montre le squelette du segment 24-48 des 20 meilleures structures, superpos´es sur 24-48 (´ecart quadratique moyen de 2,46˚A). Une autre fa¸con de visualiser la mauvaise d´efinition de ce segment est de repr´esenter l’´ecart quadratique moyen de chaque r´esidu le long de la s´equence par rapport `a la structure moyenne (figure 3.13). Si pour les r´esidus T5 `a A21 et de C49 `a L121, l’´ecart quadratique moyen par r´esidu est inf´erieur `a 1˚A, il augmente consid´erablement `a partir de la fin de l’h´elice α1b pour atteindre une valeur maximale pour le r´esidu K39 avant de revenir progressivement `a 1˚A. Ce profil est typique d’un mouvement autour d’une charni`ere form´ee par le pont disulfure C21-C53, par le peu de contraintes `a longue distance impliquant les r´esidus compris entre les deux cyst´eines et par l’absence totale de telles contraintes impliquant les r´esidus centraux. On remarque ´egalement la dispersion conformationnelle des cinq r´esidus en position N-terminale, des deux derniers r´esidus de la s´equence et du r´esidu A100.
3.2.2.2 Les structures secondaires
Les h´elices α On peut d´efinir six h´elices, dont la premi`ere est coud´ee. Afin de conserver la nomenclature de la structure de la PBP de Bombyx mori `a pH 6 ´elucid´ee par RMN (Lee et al. [2002]), ces h´elices ont ´et´e d´enomm´ees α1a(3-13),α1b(19-24),α2(31-35),α3(44-57),α4 (70-78),α5(82-99) et α6(106-121). La premi`ere h´elice α est coud´ee du fait de la pr´esence des deux prolines P16 et P20. Le coude forme un angle de 135◦.
β-hairpin et coudes Les r´esidus M60 `a K62 et E65 `a Y67 impliqu´es dans des brins β forment un β-hairpin (figure 3.14), le coude β d´efini par les r´esidus 62 `a 65 est de type I’ comme le montrent les nOes et la position des r´esidus 63 et 64 dans la carte de Ramachandran, repr´esent´es sur la figure 3.15. Le segment peptidique reliant les h´elices α3 et α4 est compos´e de quatre r´esidus (H79-A80-G81-N82). Une analyse de la conformation du squelette montre qu’ils forment un coude. Malgr´e la distance qui s´epare le proton amide de N82 de l’oxyg`ene du carbonyle de H79 (entre 3,2 et 4,3˚A), importante pour une liaison hydrog`ene, les angles di`edres des r´esidus A80 et G81 ainsi que la pr´esence de glycine en position L2 indiquent que ce coude est de type II.
3.2. Le repliement tridimensionnel d’ASP2 en complexe avec le TSP 169
Fig. 3.11: Repr´esentations de la structure d’ASP2 en complexe avec le TSP. En haut, superposition des 20 structures de plus basse ´energie entre les r´esidus 1 `a 23 et 49 `a 123. Seuls le squelette peptidique et les ponts disulfure (en noir) sont repr´esent´es. Les h´elices α sont en rouge et les acides amin´es en structure β sont en vert ; en bas, repr´esentation des structures secondaires de la structure de plus basse ´energie. Les figures de droite correspondent `a une rotation d’environ 90◦ des figures de gauche.
Fig. 3.12: Superposition du segment 24-48. Seul le squelette de cette r´egion est illustr´e.
Fig. 3.13: ´Ecart quadratique moyen par r´esidu (˚A) des atomes du squelette (en rouge) et des h´et´eroatomes de chaˆıne lat´erale (en bleu) en fonction de la s´equence.
3.2. Le repliement tridimensionnel d’ASP2 en complexe avec le TSP 171
Fig. 3.14: Corr´elations nOe observ´ees au sein du β-hairpin entre les protons amides (en bleu), les hy-drog`enes Hα (en vert) et liaisons hydrog`enes entre les oxyg`enes (en rouge) et les protons amides. En trait plein, les corr´elations fortes, en pointill´es, les corr´elations faibles.
a) b) -180-180 -120 -60 0 60 120 φ 180 -120 -60 0 60 120 180 ψ 64 63 Fig. 3.15: Coude β d´ e-fini par les r´esidus 62 `
a 65. En a), conforma-tion des r´esidus 62 `a 65 d’ASP2, en b), position des r´esidus 63 et 64 dans la carte de Ramachan-dran.
Isom´erisation des prolines La superposition des prolines des 20 structures (figure 3.16) indique que les trois prolines P16, P20 et P70 sont en conformation trans.
3.2.2.3 Arrangement des h´elices α.
La figure 3.17 rassemblent les nOes observ´es en fonction de la s´equence. La majorit´e des corr´elations concerne bien entendu des r´esidus s´equentiels ou proches dans la s´equence. Outre les trois ponts disulfure, un grand nombre de nOes (points loin de la diagonale) assurent le repliement des structures secondaires d’ASP2.
Les nOes impliquant des r´esidus proches s´equentiellement des cyst´eines permettent d’orien-ter les h´elices reli´ees par les ponts disulfure les unes par rapport aux autres (α1b− α3, α3− α6
Proline 16 Proline 20
Fig. 3.17: Distribution des nOes non ambigu¨es en fonc-tion de la s´equence. Les nOes hors diagonales (longues dis-tances) sont responsables de la structure tertiaire de la pro-t´eine. α1a α3 α4 α5 α6 α1a 70,9◦ 102,5◦ 75,4◦ 148◦ α3 70,9◦ 95,7◦ 109,1◦ 92,7◦ α4 102,5◦ 95,7◦ 152,4◦ 50,6◦ α5 75,4◦ 109,1◦ 152,4◦ 136,6◦ α6 148◦ 92,7◦ 50,6◦ 136,6◦
Tab. 3.6: Angles form´es par les h´elices d’ASP2.
et α5 − α6). Les paires d’h´elices non reli´ees par pont disulfure sont orient´ees par des nOes `a longue distance. Ainsi, l’extr´emit´e N-terminale de l’h´elice α1 montre des corr´elations avec les r´esidus I75, V78 et H79 de l’extr´emit´e C-terminale de l’h´elice α4. En particulier, un des deux m´ethyles de la valine 78 a un d´eplacement chimique n´egatif qui s’explique par la proximit´e spatiale avec les deux cycles aromatiques des tyrosines 10 et 13. La fermeture de la structure dans cette r´egion est montr´ee par les nOes pr´esents entre les r´esidus Q3 `a V7 et le cycle aroma-tique de la ph´enylalanine 122 de l’h´elice α6 C-terminale. Par ailleurs, les r´esidus de la r´egion structur´ee en β-hairpin montrent plusieurs corr´elations avec les chaˆınes lat´erales des r´esidus de la boucle liant les h´elices α5 et α6 (T64-L66 vers K101-D105).
Les h´elices α1a et α4−6 forment un faisceau d’h´elices antiparall`eles convergeant vers les ex-tr´emit´es N- et C-terminales. L’autre extr´emit´e du faisceau est ferm´ee par l’h´elice α3, fortement prot´eg´ee du solvant d’un cˆot´e par l’h´elice α1b et de l’autre cˆot´e par le β-hairpin et l’h´elice α6. Les h´elices α1a et α4−6 sont quasiment parall`eles tandis que l’h´elice α3 a une orientation glo-balement perpendiculaire aux autres (tableau 3.6). Le logiciel Molmol a d´etect´e deux liaisons hydrog`enes rigidifiant localement la structure et impliquant des chaˆınes lat´erales : N HζK62-OE59 et N HδN 82-OδD85.
La figure 3.18 d´ecrit la position des r´esidus polaires autour de l’axe des diff´erentes h´elices. La partie des h´elices expos´ee au solvant est relativement riche en amines et en acides. C’est particuli`erement vrai pour l’h´elice α6 dont l’amphiphilie est presque parfaite.
3.2. Le repliement tridimensionnel d’ASP2 en complexe avec le TSP 173
Fig. 3.18: Orientation des r´esidus autour des h´elices. En rouge, les r´esidus polaires. Les h´elices α1− α4−6sont vues suivant une vue de dessus. Le rectangle en pointill´e repr´esente grossi`erement la position de l’h´elice α3.
Fig. 3.19: Vue sur la poche hydrophobe. Les chaˆınes lat´ e-rales formant la poche sont re-pr´esent´ees.
Fig. 3.20: Une plong´ee dans la poche hydrophobe. Le point de vue est identique `a celui de la figure 3.19.
3.2.2.4 Un coeur hydrophobe
Le repliement d’ASP2 montre que l’arrangement des h´elices cr´ee une poche entour´ee de r´esidus essentiellement hydrophobes `a l’exception de la lysine 51 (figure 3.19). Les atomes impliqu´es dans la formation de la surface interne sont les suivants : HY 10, HOHY 10, SM eM 11, M eL14 δ ,M eI18 δ , HK51 α,δ,,ζ, HV 54 α,γ , SM eM 55, M eI58 δ , HM 60 γ ,SM eM 60,M eV 71 γ ,SM eM 74, M eI75 γ,δ, M eV 89 γ , HαA93, M eA93, Hδ,Y 113, HOHY 113, Hα,βT 114, HOHT 114, HβY 117,Hδ,Y 117, HOHY 117. Ces atomes sont suffisants pour couvrir au maximum la surface interne. La plupart de ces atomes sont apolaires, `a l’exception des hydroxyles des tyrosines 10, 113 et 117 et de la thr´eonine 114, concentr´ees dans une moiti´e de la cavit´e. Le segment 29-45 semble ˆetre impliqu´e dans la poche car dans les structures dont nous disposons, on observe une ouverture de la poche entre les r´esidus Y10, L14, I18, K51, T114 et I117. Si la conformation du segment mal d´efini m`ene `a une structure plus ferm´ee, il est probable que des chaˆınes lat´erales des acides amin´es Q36 `a N40 viennent refermer la poche.
La forme de la poche est globalement un pav´e de cˆot´es 7˚A*7˚A*3˚A. La figure 3.20 visualise les chaˆınes lat´erales formant la poche par trois vues successives en partant de l’ouverture. La surface a ´et´e g´en´er´ee `a partir des volumes de Van der Waals (1,4˚A). L’ouverture principale a une forme triangulaire de cˆot´e 3˚A. On peut remarquer sur la vue de droite la pr´esence d’une petite ouverture entre les acides amin´es V54 et M55 mais son diam`etre est tr`es faible. Le squelette au niveau de ces r´esidus ferme cette petite cavit´e. Elle ne doit pas avoir de rˆole particulier dans le processus d’interaction avec un ligand.
3.2.2.5 Tenseur d’inertie et surface de potentiel ´electrostatique
Le tenseur d’inertie de la structure d’ASP2 La forme globale d’une prot´eine en solution peut ˆetre approch´ee par l’analyse des axes principaux. L’axe principal de plus grand moment rejoint les atomes les plus ´eloign´es de la mol´ecule. Une mol´ecule dont les moments principaux sont de mˆeme longueur est sph´erique. Le calcul par Molmol des axes principaux de l’ensemble des 20 structures d’ASP2 indique que les moments moyenn´es sur l’ensemble sont dans un rapport de (1,00 ; 0,59 ;0,78). ASP2 pr´esente donc une structure quelque peu ´eloign´ee d’une sph`ere parfaite. La rhomboicit´e du tenseur d’inertie de la prot´eine vaut 0,60.
3.2. Le repliement tridimensionnel d’ASP2 en complexe avec le TSP 175
Fig. 3.21: Les axes principaux de la structure d’ASP2. L’axe principal le plus long est vertical.
Fig. 3.22: Surface de potentiel ´electrostatique de la structure moyenne d’ASP2. Les deux vues sont prises de part et d’autre de la structure. Les potentiels positifs sont en bleu et les potentiels n´egatifs en rouge.
l’orientation des axes est due majoritairement `a la conformation du segment 29-45. Pour la structure la plus ferm´ee (segment color´e en magenta), les rapports de longueurs principales est (1,00 ; 0,63 ; 0,79) tandis que pour la structure la plus ouverte (en noir), ces rapports sont (1,00 ;0,47 ;0,68).
Les charges de surface de la structure d’ASP2. Le calcul du potentiel ´electrostatique de surface de la structure moyenne d’ASP2 (figure 3.22) indique que le contact entre le solvant et la prot´eine est assur´e essentiellement par des chaˆınes lat´erales charg´ees (Glutamate, Aspartate et Lysine, Arginine). Lorsqu’on regarde la distribution de ces r´esidus sur la structure, `a l’exception de la lysine K51, toutes les chaˆınes lat´erales charg´ees positivement sont orient´es vers le solvant. Les zones de la surface au potentiel n´egatif (en rouge) sont dues aux chaˆınes lat´erales de Glu et Asp. A l’exception de la D85, dont le groupe acide n’est pas en contact avec le solvant, tous ces r´esidus sont orient´es vers le solvant.
Les r´esidus charg´es sont susceptibles d’ˆetre impliqu´es dans des ponts salins. D’apr`es la structure, on peut envisager la pr´esence de tels ponts entre les r´esidus K56 et E24, K62 et E59, K90 et E76, K112 et E103, N H3+ de I1 et D85.