Noyau Hα Cα Cβ C0
H´elice α -1 +1 +1 Brin β +1 -1 +1 -1
Tab. 3.2: Relation entre CSI et propension `a for-mer une structure secondaire. Un index +1 sur le Cβ n’est pas corr´el´e `a une propension `a former une h´elice α.
α. Une succession de 3 ou plus de “+1” non interrompue par un “-1” est un brin β. Les autres r´egions sont en random coil.
2. Une densit´e locale sup´erieure `a 70% est n´ecessaire pour d´efinir une structuration secon-daire. Cette densit´e locale doit ˆetre d´efinie sur une fenˆetre de 4 ou 5 r´esidus. Un minimum de 3 “+1” successifs est n´ecessaire pour en d´eduire un brin β et une h´elice α ne peut ˆetre d´efinie que par un minimum de 4 “-1” (non n´ecessairement cons´ecutifs).
3. Les extr´emit´es des structures secondaires sont reconnues par un indice oppos´e ou par la succession d’indices nuls.
La proc´edure est identique pour les Cα et C0 en inversant le signe des indices. Le cas des Cβ est diff´erent dans la mesure o`u l’indice associ´e `a ce noyau ne peut ˆetre corr´el´e `a l’identification des h´elices α, la proc´edure pr´ec´edente reste cependant valable pour l’identification des brins β, en utilisant le mˆeme signe d’indice que le Hα.
La valeur des d´eplacements chimiques random coil est tabul´ee dans le tableau 3.1. Le tableau 3.2 r´esume la propension des r´esidus `a former une h´elice α ou un brin β pour l’indice de chacun des noyaux.
Cet algorithme est impl´ement´e dans le programme CSI4
3.2 Contraintes di´edrales
3.2.1 D´efinition des angles di`edres
Les angles di`edres φ et ψ du r´esidu i du squelette sont d´efinis respectivement par les angles de torsion autour des liaisons Ci−10 − Ni − Cαi − C0
i et Ni − Cαi − C0
i − Ni+1 (voir figure 3.1). Le troisi`eme angle ω d´ecrivant la liaison peptidique est en g´en´eral plan (cis ou trans). La d´etermination des angles di`edres fournit donc des informations extrˆemement pr´ecieuses sur la g´eom´etrie du squelette d’une prot´eine. La connaissance avec une grande pr´ecision des angles di`edres du squelette et des chaˆınes lat´erales est th´eoriquement susceptible de r´ealiser le repliement de la chaˆıne peptidique.
Les param`etres g´eom´etriques angulaires d’une mol´ecule sont d’une mani`ere g´en´erale ac-cessibles en RMN par le biais des constantes de couplage 3J entre deux noyaux . L’´equation semi-empirique de Karplus (Karplus [1959]) relie les constantes de couplage 3J entre deux noyaux quelconques s´epar´es de trois liaisons formant un angle di`edre θ :
3J = A cos2θ + B cos θ + C (3.1) Dans le cas des angles di`edres du squelette d’une prot´eine, Pardi (Pardi, Billeter, and W¨uthrich [1984]) a pr´ecis´e la valeur des constantes A, B et C pour le couplage 3JHNHα et
Fig. 3.1: D´efinition des angles di`edres du squelette peptidique (φ,ψ et ω) et de la chaˆıne lat´erale (χ1, χ2).
Fig. 3.2: Courbe de Karplus re-liant la constante de couplage
3JHNHα`a l’angle di`edre φ. Les in-tervalles pour la constante de cou-plage des h´elices α droites et des feuillets β canoniques sont indi-qu´ees en fonction des valeurs angu-laires permises.
l’angle di`edre φ :
3J (θ) = 6, 4 cos2θ − 1, 4 cos θ + 1, 9 avec θ = |φ − 60◦| (3.2)
3.2.2 D´etermination exp´erimentale des angles φ : HNHA
L’exp´erience 3D-HNHA (Vuister and Bax [1993],Vuister and Bax [1994]) permet d’obtenir d’une mani`ere quantitative des plages de valeurs pour les angles φ du squelette. Le coeur de cette s´equence (figure 3.3) r´eside dans les deux modules HMQC o`u l’aimantation Hy est transf´er´ee sur l’azote (entre a et b), le d´eplacement chimique de l’azote ´edit´e entre b et c, et le couplage 3J(HNHα) s’expriment. Le couplage JHNN ne s’exprime pas entre b et c car il n’a aucun effet sur les termes `a 0 et 2 quanta. Les d´eplacements chimiques des protons HN et Hα sont ´edit´es pendant t2. Le deuxi`eme module HMQC entre d et f permet de revenir sur le proton amide pour la d´etection. La s´equence originelle a ´et´e modifi´ee par l’ajout d’une Watergate (Piotto et al. [1992]) avant l’acquisition pour am´eliorer la suppression du solvant. La derni`ere impulsion 90◦Φ9 s´electionne les ´etats qui vont donner un signal purement en absorption mais en contrepartie, elle m`ene `a un rapport Signal/Bruit plus faible. Le d´elai δ est ajust´e `
a 1/(2JHNN) pour optimiser le transfert HN
y → HN
3.2. Contraintes di´edrales 73
Fig. 3.3: S´equence d’impulsion de la 3D-HNHA. Les rectangles ´etroits et larges sont respectivement des impulsions 90◦et 180◦. La suppression de l’eau est assur´ee par une Watergate. Le cyclage de phase sur 16 phases est le suivant : Φ2 = x; Φ3 = 4x, −4x; Φ4 = x, −x; Φ5= 2x, −2x; Φ6= 4x, −4x; Φ7 = x; Φ8 = 8x, 8y; Φ9 = y, −y; Φr´ecepteur= 8x, −8x. Les d´elais ζ et δ valent respectivement 13, 05ms et 4, 5ms. Les gradients sont successivement d’intensit´e 2%, −2% et 15%.
optimiser le transfert HyN → HN
x Hzα. Il est l´eg`erement inf´erieur `a 1/(2JHNHα) pour augmenter la sensibilit´e de l’exp´erience (relaxation T2). Les deux dimensions ont ´et´e accumul´ees en mode States-TPPI (Marion et al. [1989]).
Le signal d´etect´e pendant l’acquisition est d´ecrit par :
S(t1, t2, t3) = Acos(ωNt1)eiωHNt3cos2(2πJHNHαζ) cos(ωHNt2) − sin2(2πJHNHαζ) cos(ωHαt2) (3.3)
Apr`es transform´ee de Fourier, aux d´eplacements chimiques de l’azote et du proton amide du r´esidu i, il y aura deux pics : un pic sur la diagonale correspondant `a l’aimantation rest´ee sur HN pendant les modules HMQC et un pic hors-diagonale au d´eplacement chimique du Hα du r´esidu i. Le rapport d’intensit´e des deux pics s’exprime alors par :
Ihors−diagonale Idiagonale
= − tan2(2πJHNHαζ) (3.4) L’estimation de JHNHα s’obtient par inversion de cette relation. L’expression 3.3 n’est pas rigoureusement exacte dans la mesure o`u les ´etats 2IHN
x IHα
z et IHN
y donnant lieu aux deux termes de la somme ´evoluent avec un temps de relaxation diff´erent pendant le temps 2ζ. Dans la limite des mouvements lents pour les prot´eines, l’´etat antiphase 2IHN
x IHα
z relaxe plus rapidement que la composante en phase IHN
y , entraˆınant une diminution de l’intensit´e du pic hors-diagonale par rapport au pic de la diagonale. Vuister et Bax ont propos´e d’appliquer un facteur correctif global de 1,11 `a l’ensemble des couplages mesur´es. Cette correction appliqu´ee `
a la nucl´ease du staphylocoque (SNase) est justifi´ee pour les r´esidus pr´esentant peu de mobilit´e interne.
Le cas des glycines est particulier car ces r´esidus portent deux protons Hα qui vont cha-cun participer au d´ephasage de HN
x pendant le d´elai 2ζ. L’interaction dipolaire forte entre les protons g´eminaux va induire une diminution de l’intensit´e de la tache la plus intense et une
feuillet β h´elice α structure ´etendue
3JHNHα(en Hz) φ(en degr´e) 3JHNHα(en Hz) φ(en degr´e) 3JHNHα(en Hz) φ(en degr´e)
> 9,5 -120±25 > 6,4 -80±25 > 7,0 -120±55
entre 8,0 et 9,5 -120±35 entre 5,5 et 6,5 -70±25 < 7,0 ind´etermination entre 7,0 et 8,0 -120±55 < 5,5 -60±25
< 7,0 -115±60
Tab. 3.3: Plage de valeurs de Φ en fonction de la structure secondaire et de la valeur de J
augmentation de l’intensit´e de la tache la plus faible. En l’absence d’attribution st´er´eosp´ eci-fique, il n’est pas possible de conclure sur la valeur de φ.
Fig. 3.4: Evolution de
3JHNHα en fonction du rapport Ihors−diag/Idiag.
3.2.3 Pr´ediction des angles φ et ψ du squelette : Talos
Cornilescu (Cornilescu et al. [1999a]) a prolong´e l’´etude de Wishart sur la relation entre d´eplacements chimiques et structure secondaire d’une prot´eine. Il a mis au point un algorithme de pr´ediction des angles de torsion utilisant la s´equence et les d´eplacements chimiques Hα, N , Cα, Cβ et C0 de la prot´eine. Le principe sous-jacent `a ce travail est que si une succession d’acides amin´es montre une similarit´e de d´eplacements chimiques avec une s´equence d’une prot´eine de structure connue, alors les r´esidus centraux des deux chaˆınes ont probablement les mˆemes angles de torsion φ et ψ. De plus, si les deux chaˆınes ont une grande similarit´e de s´equence, alors la m´ethode devient encore plus robuste. Bien que le d´eplacement chimique de l’azote soit influenc´e par les liaisons hydrog`enes, la mise au point de la proc´edure a montr´e qu’il pouvait ˆetre pris en compte mais avec un poids relativement faible.
Le logiciel Talos5 automatise la pr´ediction des angles de torsion en acceptant en entr´ee la s´equence en acides amin´es et le d´eplacement chimique des diff´erents noyaux. Le logiciel dispose d’une base de donn´ees de 20 structures `a haute r´esolution et de leur attribution. Il ´
evalue ensuite la similarit´e Sij entre le triplet (3 acides amin´es successifs) centr´e sur le r´esidu i de la s´equence entr´ee et tous les triplets j de la base de donn´ees. Ce facteur est calcul´e sur la base de la diff´erence de d´eplacements chimiques des 3*5=15 noyaux et de la comparaison de