Discussion

Nous venons de discuter des caract´eristiques de la structure d’ASP2 en complexe avec le TSP. Le lecteur aura remarqu´e que le TSP n’a pas ´et´e introduit dans la mod´elisation. La mod´elisation avec le TSP n’aurait sans doute pas am´elior´e le calcul. En effet, le TSP est deut´er´e `

a l’exception des 3 groupes m´ethyles. Par cons´equent, les contraintes possibles n’impliqueraient que ces m´ethyles et ne pourraient en aucun cas contraindre la chaˆıne aliphatique du TSP. Compte tenu de la r´esolution et du nombre de contraintes utilis´ees, il est raisonnable de consid´erer que la structure obtenue est bien celle d’ASP2 en complexe.

Le cas du segment 29-48 est `a consid´erer plus avant. Les diff´erentes cartes NOESY que j’ai accumul´ees contiennent des signaux provenant de cette r´egion de la prot´eine, mais ceux-ci sont faibles, voire tr`es faibles (r´esidus I31, T33, N34, I35). D’autre part, les d´eplacements chimiques de ces r´esidus sont tels que les quelques nOes engageant ces r´esidus ont men´e `a de tr`es nombreuses d’ambigu¨ıt´es d’attribution, rendant le processus de reconstruction manuelle caduque sur cette r´egion. L’utilisation d’Aria n’a pas fourni de nouvelles contraintes, et ce, sans doute `a cause de l’algorithme d’attribution d’Aria : aucun poids n’est ajout´e au terme d’´energie lorsqu’un pic est ´elimin´e, et ce, pour pouvoir discriminer entre bruit et signal. Les quelques nOes pouvant a priori contraindre fortement l’orientation de ce segment par rapport au coeur de la prot´eine ont ´et´e ´elimin´es ou attribu´es vers des contraintes `a moyenne distance (structure secondaire). A ce moment de la reconstruction s’est donc pos´ee la question : le segment 29-45 est-il sous plusieurs conformations ou en dynamique interne originale, menant `

a des signaux faibles, ou alors, serait-ce un exemple de limitation de la RMN `a l’´etude d’une prot´eine d’une taille respectable. Il se peut en effet que par malchance, les proximit´es spatiales n’ont pu ˆetre observ´ees car superpos´ees `a d’autres. Afin de r´epondre `a cette interrogation cruciale, le deuxi`eme objectif initial de la th`ese (´etude de la dynamique interne d’ASP2) a pris tout son sens. Le chapitre suivant d´ecrira les r´esultats des diff´erentes exp´eriences de relaxation men´ees sur le squelette d’ASP2 ainsi que leur interpr´etation et la signification de la structure au vu de ces r´esultats.

Chapitre 4

La dynamique d’ASP2 `a 308K et `a

283K

Une ´etude compl`ete de la relaxation de l’azote <sup>15</sup>N du squelette a ´et´e men´ee `a 308K, soit la temp´erature `a laquelle la structure a ´et´e r´esolue. Pour analyser l’effet de la temp´erature, en particulier sur le segment mal d´efini de la structure, j’ai men´e la mˆeme s´erie d’exp´eriences `a 283K. Les r´esultats `a 308K seront amplement d´etaill´es (section 3.1 `a 3.3) et la comparaison entre les deux temp´eratures sera discut´ee qualitativement dans la section 3.4. Nous verrons ensuite comment la dynamique du squelette peut ˆetre reli´ee `a la structure obtenue.

4.1 Les donn´ees de relaxation R

, R

et l’effet nOe h´

e-t´eronucl´eaire `a 308K.

La mesure des constantes de relaxation du spin azote 15 a ´et´e men´ee sur un tube d’ASP2 marqu´e15N , fraˆıchement dissoute dans 450µl d’eau (10% de D2O) `a pH=6 en l’absence de sel et avec le TSP dans un rapport de 5 :1.

Un ´echantillonnage correct de la courbe de relaxation T₁ impose de prendre des points r´epartis de fa¸con homog`ene jusqu’`a l’extinction du signal. Nous avons choisi de prendre les valeurs suivantes de δ : 12, 48, 72, 128, 300, 420, 600, 840 et 1200ms. Les spectres ont ´et´e accumul´es dans le d´esordre afin d’´evacuer toute erreur syst´ematique. De plus, le point `a 72ms a ´et´e doubl´e pour estimer l’erreur sur les intensit´es et pour v´erifier qu’il y avait pas eu de d´erive du champ ou de l’homog´en´eit´e du champ durant la dur´ee de l’exp´erience. Le gain avant l’´echantillonnage num´erique doit ˆetre identique quel que soit le d´elai pour une comparaison possible des intensit´es relatives. L’´echantillonnage de la courbe mono-exponentielle de relaxa-tion transversale a consist´e en 8 points : 8, 16, 32, 48, 64, 136, 256, 400ms. Les points `a 48, 64 et 256ms ont ´et´e doubl´es. Comme R₂ ≥ R₁, la d´ecroissance est plus rapide dans le cas de la mesure de R2 que de la mesure de R1, par cons´equent le dernier point de R2 est plus court (400ms) que pour R₁ (1200ms).

Les spectres ont ´et´e enregistr´es sur le spectrom`etre Bruker 600MHz. Chaque exp´erience a ´et´e r´ealis´ee avec 128 points complexes en dimension indirecte et 1024 en dimension d’ac-quisition. Pour chaque t<sub>1</sub>, 16 passages ont ´et´e enregistr´es. Un filtre sinus a ´et´e appliqu´e dans les deux dimensions. Chaque dimension a ´et´e compl´et´ee par zero-filling jusqu’`a une taille de

Fig. 4.1: Superposition de deux spectres de me-sure de R₁ `a 12ms (bleu) et `a 600ms (rouge) `a 308K. Les deux spectres sont repr´esent´es avec le mˆeme niveau d’affichage. L’intensit´e `a long d´ e-lai de relaxation est ce-lairement plus faible qu’`a court d´elai.

Fig. 4.2: Superposition de deux spectres de me-sure de R₂ `a 8ms (bleu) et `a 256ms (rouge) `a 308K. Les deux spectres sont repr´esent´es avec le mˆeme niveau d’affichage. L’intensit´e `a long d´ e-lai de relaxation est ce-lairement plus faible qu’`a court d´elai.

Fig. 4.3: Superposition de deux spectres de me-sure de l’effet nOe h´et´eronucl´eaire `a 308K repr´ e-sent´es au mˆeme niveau. Seuls les niveaux posi-tifs sont affich´es. En noir, le spectre non satur´e ; en rouge, le spectre satur´e. La baisse d’intensit´e due `a l’effet nOe est visible entre autres sur le r´esidu C-terminal (123) tandis que l’effet nOe de l’azote du r´esidu 106 est plus proche de la limite sup´erieure.

Fig. 4.4: Exemples d’ajustement de R2. La d´ e-croissance plus lente de l’intensit´e de la glycine 41 traduit un R₂ plus ´elev´e que pour les r´esidus 66 et 122. La forte dispersion des intensit´es du r´esidu 41 conduit `a une incertitude plus ´elev´ee sur le R₂ de ce r´esidu.

4.1. Les donn´ees de relaxation R₁, R₂ et l’effet nOe h´et´eronucl´eaire `a 308K. 179 R₁ (Hz) R₂ (Hz) R₁/R₂ Effet nOe h´ e-t´eronucl´eaire 1H-¹⁵N

Fig. 4.5: Valeurs de R1, R2, R1/R2 et nOe h´et´eronucl´eaire d’ASP2 `a 308K (en rouge) et `a 283K (en bleu) `a 600MHz. Valeurs en Annexe F.

256x2048 points avant transform´ee de Fourier et une correction de ligne de base a ´et´e effectu´ee. Le logiciel NmrPipe a servi pour le traitement.

Pour la mesure de l’effet nOe h´et´eronucl´eaire, j’ai fix´e le d´elai d₁ d’´etablissement de l’´equilibre sous irradiation des protons amides `a 10s `a 308K (∼ 20T1(Nz)) et `a 5s `a 283K (∼ 6T₁(N_z)). Chaque spectre a ´et´e accumul´e sur 32 passages pour obtenir une matrice com-plexe de 200*1024 points.

Les figures 4.1, 4.2 et 4.3 repr´esentent quelques spectres accumul´es pour la mesure des vitesses de relaxation et de l’effet nOe h´et´eronucl´eaire. La figure 4.4 donne trois exemples du fit des intensit´es mesur´ees sur les spectres de mesure de R₂ pour les r´esidus G41, L66 et F122. En suivant les protocoles d´ecrits dans la partie m´ethodologie, j’ai extrait les vitesses de relaxation longitudinale et transversale des spins azote 15 du squelette de 96 r´esidus. Un ajustement monoexponentiel a pu ˆetre obtenu pour tous les r´esidus, l’hypoth`ese qui n´eglige la relaxation crois´ee est donc justifi´ee. A pH 6, tous les r´esidus autres que N-ter et les prolines donnent une tache de corr´elation, y compris les r´esidus de la r´egion relativement flexible dans la structure obtenue. Pour des raisons de superpositions de d´eplacements chimiques, les param`etres de relaxation n’ont pu ˆetre obtenus pour les 22 acides amin´es suivants : V7-I18-I27, M11-T64, A22-E69, D23-D40, K39-L47-I86, Q46-K90, K56-V78, R57-I109, K62-A83, I97-Y117. Par ailleurs, la tache de corr´elation du r´esidu 26 ´etait trop faible dans les spectres `

a long d´elai par rapport `a son voisin N99 pour pouvoir donner des valeurs acceptables. Je l’ai donc exclu par la suite. Je disposais donc d’un jeu de param`etres de relaxation complet pour 96 r´esidus r´epartis de fa¸con homog`ene le long de la s´equence. Les valeurs de R₁, R₂ et nOe h´et´eronucl´eaire sont rassembl´es dans les figures 4.5.

La vitesse de relaxation longitudinale R₁ moyenne sur l’ensemble de la s´equence est de 2Hz. L’´ecart-type moyen vaut 0,16Hz soit une incertitude moyenne de environ 8%. Except´e le r´esidu en position C-terminale, les valeurs de R₁ s’´ecartent peu de la valeur moyenne (entre 1,74 et 2,23Hz).

La vitesse de relaxation transversale R₂ moyenne sur l’ensemble de la s´equence est 6,7Hz avec une incertitude moyenne de 0,45Hz, soit environ 7%. La dispersion des R₂ est beaucoup plus importante que les R₁. On remarque qu’une majorit´e des r´esidus ont leur R₂ compris autour de la valeur moyenne de 7Hz . Les r´esidus en position N-ter (de 2 `a 6) voient leur R<sub>2</sub> augmenter progressivement pour atteindre la valeur moyenne. Deux autres zones (de Q36 `

a K51 et de G102 `a D105) comportent ´egalement des valeurs de R<sub>2</sub> significativement plus faibles que la moyenne. La premi`ere zone correspond `a la seconde moiti´e de la r´egion de la structure mal d´efinie tandis que la seconde forme la boucle entre les deux derni`eres h´elices α. Certains r´esidus ont des valeurs de R₂ se distinguant particuli`erement de leurs voisins : ce sont les r´esidus T33, G48, C49 et T114 avec un R<sub>2</sub> tr`es ´elev´e (sup´erieure `a 8Hz) et S28 et E59 (R<sub>2</sub> inf´erieur `a 5Hz). La premi`ere s´erie de r´esidus (R₂ ´elev´es) est susceptible de pr´esenter de l’´echange chimique du fait d’un terme de relaxation suppl´ementaire tandis que les deux r´esidus de faible R₂ ont une dynamique interne importante dans la gamme pico- nanoseconde.

Les valeurs de nOe h´et´eronucl´eaire sont toutes inf´erieures `a la limite maximale autoris´ee par la th´eorie except´e les r´esidus C21, L50, M55, C107 et E119 dont l’intervalle de confiance ne contient pas la valeur 0,83. On peut expliquer ces valeurs soit par une incertitude sous-estim´ee, soit par une saturation partielle de l’eau durant l’exp´erience de r´ef´erence, menant `

a une sous-estimation de l’intensit´e de r´ef´erence (Grzesiek and Bax [1993]). Pour les autres r´esidus, le nOe est compris entre 0,23 et 0,83. Il se d´egage les mˆemes tendances que pour les

4.2. Temps de corr´elation `a 308K 181