A l’heure actuelle, la structure de trois prot´eines d’invert´ebr´es de la famille des OBPs ou apparent´ees ont ´et´e ´elucid´ees.
2.1.4.1 La PBP de Bombyx mori : la premi`ere structure d’OBP d’insectes Bombyx mori est le papillon aussi appel´e bombyx du mˆurier, ou papillon du ver `a soie. Il s’agit du mod`ele d’invert´ebr´e le plus observ´e dans le cadre de la recherche sur l’olfaction. Ce papillon communique avec les autres membres de son esp`ece par le biais de ph´eromones. La premi`ere ph´eromone (bombykol) fut isol´ee et caract´eris´ee chez le papillon du ver `a soie par Butenandt en 1959. Comme mesur´e par les ´etudes de dichro¨ısme circulaire (Wojtasek and Leal [1999]) et de RMN (Damberger et al. [2000]), BmPBP adopte un repliement diff´erent en fonction du pH. Les deux conformations sont en ´equilibre lent pour un pH compris entre 4,9 et 6,0.
La structure cristallographique de la PBP de Bombyx mori `a pH basique (pH>6,5) a ´et´e d´etermin´ee par Sandler (figure 2.5, Sandler et al. [2000]) en 2000, suivi par la r´esolution par RMN par Lee (Lee et al. [2002]). La BmPBP complex´ee avec le bombykol cristallise sous la
Fig. 2.5:
Structure cristallographique de BmPBP en complexe avec le bombykol.
Fig. 2.6: Structure RMN de BmPBPB. A droite, superposition des 20 structures de plus basse ´
energie. A gauche, repr´esentation des structures secondaires d’une des structures. Les ponts disulfures sont montr´es en couleur cyan (reproduction de Lee et al. [2002]).
forme d’un homodim`ere de 2x15,9kDa. La structure de chaque monom`ere est identique et est compos´ee de six h´elices, not´ees α1 `a α6. La premi`ere h´elice est coud´ee (α1a-α1b). L’extr´emit´e C-terminale (129-137) est en conformation ´etendue et flanqu´ee entre l’h´elice α1aet l’h´elice α2 `a la surface de la prot´eine. Le bombykol est li´ee `a la BmPBP par chaque monom`ere, impliquant des r´esidus globalement hydrophobes de la poche d´elimit´ee par les quatre h´elices antiparall`eles α1, α4, α5 et α6. Les ph´enylalanines 12 et 118 cr´eent une surface hydrophobe, tandis que les chaˆınes lat´erales de M61, L62, I91 et V114, r´esidus plus variables, sont probablement `a l’origine de la sp´ecificit´e du ligand.
La structure obtenue en solution par RMN `a pH basique (BmPBPB, figures 2.6) en ab-sence de bombykol est tr`es proche de la structure cristalline. L’h´elice α1 situ´ee en position N-terminale est s´epar´ee en deux α1a(3-8) et α1b( 16-22). La superposition des 20 structures de plus basse ´energie montre que l’extr´emit´e C-terminale (129-142) est peu rigide. De mˆeme, la r´egion comprise entre les r´esidus 33 et 45 montre une plus grande flexibilit´e que le reste de la
2.1. Les connaissances actuelles sur les OBPs 37
Fig. 2.7: Structure RMN de BmPBPA. A droite, superposition des 20 structures de plus basse ´energie. A gauche, repr´esentation des structures secondaires d’une des structures. Les chaˆınes lat´erales de plus faible exposition au solvant, qui forment le coeur hydrophobe, sont repr´esent´es : en jaune, les chaˆınes lat´erales de l’h´elice α7, en orange, les autres. Les ponts disulfures sont repr´esent´es en vert (reproduction de Horst et al. [2001]).
prot´eine. La mod´elisation mol´eculaire refl`ete le peu de contraintes `a moyenne distance (struc-turation secondaire) et l’absence de nOe `a longue distance (repliement tertiaire) concernant les hydrog`enes de ces deux r´egions. Ces observations de la mod´elisation furent confirm´ees par la mesure de l’effet Overhauser entre les noyaux15N et 1H, exp´erience qui met en ´evidence la flexibilit´e du squelette de la chaˆıne polypeptidique. L’absence de ligand n’induit donc pas de modification majeure de la structure.
A bas pH (4,5), la structure, BmPBPA, est consid´erablement modifi´ee. Les six h´elices de la structure `a haut pH ont une orientation identique, par contre, le segment C-terminal, ´etendu `
a haut pH, se structure en h´elice α localis´ee dans le coeur de la structure (figures 2.7). L’h´elice α7 occupe alors l’espace qui correspond au site de fixation de la ph´eromone dans la structure cristalline du complexe. Le m´ecanisme probable de relarguage du ligand est donc identifi´e :
1. le ligand se fixe sur BmPBP au pH de la lymphe sensillaire,
2. Au contact des membranes, le pH diminue (van der Got et al. [1991]) et BmPBP change de conformation
3. le ligand est chass´e par la formation de l’h´elice α au coeur de la structure.
Ce mod`ele ne peut ˆetre g´en´eralis´e car la fixation de la ph´eromone sur la PBP de Lymantria dispar est conserv´e `a pH 4 (Kowcun et al. [2001]). De plus, ce m´ecanisme ne peut exister dans le cas d’OBP plus courtes, telles que la PBP de Leucophaea maderae (Rivi`ere et al. [2003]).
L’´etat oligom´erique de la PBP de Bombyx mori est `a mettre en lumi`ere des ´etudes de gel filtration (Leal [2000]) : `a bas pH (pH<4,5), BmPBP est sous forme monom´erique et `a haut pH (pH>6), BmPBP est dim´erique. BmPBP est un dim`ere `a haut pH dans la forme cristalline alors que la structure en solution semble ˆetre monom´erique. D’autre part, la structure `a bas pH semble ˆetre monom´erique.
Fig. 2.8: Structure RMN de CSPMbra6 Fig. 2.9: Structure RMN de THP12
2.1.4.2 CSPMBra6 et THP12
Les deux autres structures de prot´eines apparent´ees aux OBPs sont CSPMbra6 et THP12. CSPMbra6 (Lartigue et al. [2002], Mosbah et al. [2002]) est une CSP produite dans les antennes et le proboscis du papillon Mamestra brassicae tandis que THP12 fait partie d’une famille de prot´eine de transport de l’h´emolymphe du scarab´ee Tenebrio molitor. Elles sont plus courtes que la PBP Bombyx mori (112aa et 108aa respectivement) et ne partagent qu’une tr`es faible homologie de s´equence entre elles et avec l’ensemble des OBPs, y compris BmPBP. Par contre, leurs structures sont similaires et sont proches de celle de BmPBP `a haut pH. Elles font toutes partie de la famille des structures hexah´elicales.
La structure de THP12 (Rothemund et al. [1999]) est celle qui se rapproche le plus de BmPBPB. Les cinq h´elices α2− α6 ont quasiment la mˆeme orientation relative dans les deux structures. L’h´elice N-terminale α1 est mal d´efinie. Contrairement `a BmPBP, le site de fixation des ligands (acides gras et ph´eromone 4-m´ethylnonanol) est un sillon hydrophobe .