Interpr´ etation de la fonction de densit´ e spectrale en terme de mou-

evidence la pr´esence d’´echange chimique au sein de certains r´esidus d’ASP2 (5.2.1.4).

5.1.7 Interpr´etation de la fonction de densit´e spectrale en terme de

mouvement

La mesure de R₁, R₂ et η est utilis´ee pour d´eterminer la valeur de la fonction de densit´e spectrale aux fr´equences 0, ω_S et ω_H et donc la r´epartition en fr´equences des mouvements d’un vecteur. Si le vecteur ´etudi´e appartient `a une prot´eine, l’´evolution des trois valeurs de densit´e spectrale le long de la s´equence peptidique nous renseigne d´ej`a sur les r´esidus ayant un comportement dynamique original. Cependant, il est plus confortable de travailler sur des mouvements et pour cela, il est indispensable de proposer des mod`eles de mouvements pour recalculer les fonctions de densit´e spectrale. Nous nous contenterons de citer le mod`ele model-free.

5.1. ´El´ements de th´eorie 111

a) Mod`ele de la sph`ere rigide b) Mod`ele Lipari-Szabo c) Mod`ele Lipari-Szabo ´etendu

Fig. 5.4: La fonction d’autocorr´elation G des trois mod`eles (l’´echelle en abscisse est logarithmique).

5.1.7.1 L’analyse des donn´ees par model-free

Le mod`ele le plus couramment employ´e `a l’heure actuelle est le mod`ele de Lipari-Szabo, aussi appel´e model-free (Lipari and Szabo [1982a,b]). G. M. Clore et ses coll`egues l’ont am´elior´e en introduisant les mouvements internes lents (model-free ´etendu, Clore et al. [1990a]). Ces mod`eles se basent en premi`ere approche sur le mouvement d’une mol´ecule sph´erique rigide en rotation globale isotrope (temps de corr´elation τ_c), puis les mouvements internes sont pris en compte par un param`etre d’ordre g´en´eralis´e S<sup>2</sup> et du temps de corr´elation τe (model-free). Un troisi`eme temps de corr´elation et un second param`etre d’ordre associ´es aux mouvements internes interm´ediaires sont introduits quand leurs effets ne sont plus n´egligeables en terme de fonction de d’autocorr´elation G(τ ) (model-free ´etendu).

Rotation globale isotrope. Pour une mol´ecule rigide anim´ee d’un mouvement brownien isotrope, les vecteurs intramol´eculaires −−→

XH d’une prot´eine se r´eorientent de la mˆeme fa¸con en suivant le temps de corr´elation global τ_c de la prot´eine. La fonction d’auto-corr´elation de la prot´eine est une monoexponentielle de param`etre τ_c (figure 5.4a) et la fonction de densit´e spectrale s’exprime simplement :

Jrigide(ω) = ^τc

1 + ω2τ_c2 (5.12) Model-free (Lipari and Szabo [1982b,a]) Pour tenir compte des mouvements internes et donc de la dynamique du squelette peptidique ou des chaˆınes lat´erales, on consid`ere que la d´ecorr´elation s’effectue en deux ´etapes. La premi`ere ´etape permet au vecteur d’explorer l’espace de ses orientations possibles. Cela se traduit par une d´ecorr´elation rapide (figure (5.4b)) jusqu’`a un plateau `a S². Le temps de corr´elation τeest la surface balay´ee jusqu’`a S<sup>2</sup>. S<sup>2</sup> est le param`etre d’ordre qui refl`ete l’amplitude des mouvements. L’interpr´etation du temps de corr´elation τ<sub>e</sub> est d´elicate et en g´en´eral, il n’est pas directement traduit par une repr´esentation des mouvements rapides. Cette dur´ee d´epend du type de mouvement consid´er´e et peut varier de quelques pisosecondes pour une rotation d’un groupe m´ethyle, `a quelques nanosecondes pour les mouvements des vecteurs −−→

N H dans les boucles et les coudes. Le param`etre d’ordre S² traduit l’amplitude des mouvements internes.

Ces mouvements restent suffisamment restreints pour que la relaxation soit gouvern´ee en premier lieu par la r´eorientation globale de la prot´eine. Aucune hypoth`ese n’est n´ecessaire a

priori sur le type de mouvement (diffusion dans un cˆone, sur un cˆone, . . . ). Les mouvements internes des vecteurs−−→

XH provoquent une d´ecorr´elation rapide de la fonction d’auto-corr´elation d’un facteur d’ordre S2. Ce param`etre d’ordre g´en´eralis´e peut ˆetre interpr´et´e comme ´etant l’amplitude de ces mouvements. Un param`etre d’ordre proche de 1 signifie que le vecteur −−→

XH est fortement restreint autour de son orientation moyenne dans la mol´ecule, elle-mˆeme en rotation. Par contre, un param`etre d’ordre tr`es inf´erieur `a 1 indique que le vecteur balaie un angle solide relativement grand. Si S2 = 0, le vecteur −−→

XH peut alors balayer toutes les orientations de mani`ere ´equiprobable. La fonction de densit´e spectrale construite par Lipari et Szabo prend en compte les deux types de mouvements :

J_LP(ω) = S^{2 τc} 1 + (ωτ_c)2 + (1 − S²) ^τ 0 e 1 + (ωτ0 e)2 (5.13) avec _τ¹0 e = _τ¹ c +_τ¹ e

Ils sont caract´eris´es par des temps de corr´elation tr`es diff´erents. τ_eet τ_c valent typiquement 50ps et 10ns pour une prot´eine de poids mol´eculaire de l’ordre de la dizaine de kDa :

Sous la condition τ_e  τ_c (mouvements internes tr`es rapides), la fonction de densit´e spec-trale peut ˆetre simplifi´ee en perdant un param`etre ajustable :

JLP(ω) = S^{2 τc}

1 + (ωτ_c)2 (5.14) Model-free ´etendu (Clore et al. [1990a,b]) Pour certains r´esidus en boucle, dans un coude β , `a la surface de la prot´eine ou `a l’extr´emit´e de brins β, le mod`ele de Lipari-Szabo n’est plus valable. La complexit´e des mouvements internes ne peut plus ˆetre d´ecrite par un seul palier `a S². Clore et ses coll`egues ont ajout´e un second palier associ´e `a un second cor-r´elation interne afin de tenir compte des mouvements interm´ediaires (τ_s de 100ps `a quelques nanosecondes, param`etre d’ordre S2

s, S2 = S2 sS2

f) afin d’expliquer les mesures exp´erimentales. Les mouvements sur l’´echelle de temps de la picoseconde sont d´ecrits par τ_f et S_f². Les mou-vements internes rapides et interm´ediaires sont consid´er´es comme d´ecorr´el´es. Les mouvements interm´ediaires peuvent ˆetre par exemple associ´es `a un saut entre deux sites et les mouvements rapides `a la diffusion du vecteur autour de ces deux sites. Cette hypoth`ese de travail m`ene `a une nouvelle fonction de densit´e spectrale `a cinq param`etres (τ_c, S2, τ_s, S2

f et τ_f) : J_´etendu(ω) = S^{2 τc} 1 + (ωτ_c)2 + (S_f²− S2) ^τ 0 s 1 + (ωτ0 s)2 + (1 − S_f²) ^τ 0 f 1 + (ωτ_f⁰)2 (5.15) avec _τ¹0 s = _τ¹ c +_τ¹ s, _τ¹0 f = _τ¹ c + _τ¹ f et S² = S_f²S_s²

Sous l’hypoth`ese τ<sub>f</sub> → 0, cette fonction se simplifie et ne d´epend plus que quatre param`etres (τ_c, τ_s, S2, S2 f) : J_etendu(ω) = S^{2 τc} 1 + (ωτc)2 + (S_f²− S2) ^τ 0 s 1 + (ωτ0 s)2 (5.16)

5.1. ´El´ements de th´eorie 113 Le mod`ele de Lipari-Szabo est inclus dans celui-ci dans le cas o`u S_f² = 1 et τf = 0 (mouvements internes rapides sans effet sur la relaxation) ou S2 = S2

f. On identifie alors τ_s = τ_e.

Les donn´ees exp´erimentales peuvent donc r´epondre `a plusieurs mod`eles contenant un nombre diff´erents de param`etres ajustables. Les logiciels Tensor2 et Modelfree utilisent les 5 mod`eles suivants (par ordre croissant du nombre de param`etres ajustables, y compris le terme d’´echange R_ex) avec la mˆeme num´erotation :

Mod`ele Hypoth`ese(s) Param`etres

1. Lipari-Szabo simplifi´e τeest rapide (τe< 20ps) S2

2. Lipari-Szabo classique τeest actif sur la relaxation S2et τe

3. Lipari-Szabo simplifi´e avec ´echange Comme au 1. et pr´esence d’´echange S2et Rex

4. Lipari-Szabo classique avec ´echange Comme au 2. et pr´esence d’´echange S²,τeet Rex

5. Lipari-Szabo ´etendu 2 types de mouvements : S2

s, τs(lent) et S2

f,τf (rapide) S2 f,S2

s et τe= τs

et τf est n´egligeable

Tab. 5.1: D´efinition des mod`eles utilis´es par Tensor2 et model-free.

La prise en compte du terme d’´echange dans le mod`ele ´etendu am`ene le syst`eme `a quatre inconnues pour trois mesures. La mesure `a deux champs double le nombre de mesures. La d´ependance en champ de R<sub>1</sub>, R<sub>2</sub> et de R<sub>ex</sub> ´etant diff´erente, il devient alors possible de recon-naˆıtre les r´esidus pr´esentant `a la fois une dynamique interne `a deux temps de corr´elation et de l’´echange chimique. Dans le cas d’ASP2, nous nous sommes satisfaits des mesures `a un seul champ. Seuls trois param`etres restent simultan´ement accessibles.

5.1.7.2 Quel mod`ele est choisi par le protocole ?

J’ai utilis´e deux logiciels Tensor217 (Dosset et al. [2000]) et ModelFree18 associ´e `a FAST-Modelfree<sup>19</sup>(Cole and Loria [2003]) pour mod´eliser les mouvements.. Ces deux approches s’ap-puient sur le protocole publi´e par Mandel (Mandel et al. [1996]), bri`evement d´ecrit au para-graphe suivant. D’une utilisation simple (un minimum de param`etres de calculs `a ajuster), ils sont limit´es dans la mesure o`u ils restent des “boˆıtes noires”. Pour valider les r´esultats, j’ai choisi de comparer l’analyse de la dynamique en utilisant `a la fois les deux logiciels. Il leur suffit de connaˆıtre les valeurs de R₁, R₂ et η avec leurs incertitudes exp´erimentales pour d´eterminer les param`etres de mobilit´e de chaque r´esidu.

Algorithme du choix du mod`ele. Les mod`eles d´efinis au paragraphe pr´ec´edent com-portent `a chaque fois des degr´es de complexit´e suppl´ementaires. Il est possible d’affiner le mod`ele en ajoutant autant de temps de corr´elation que souhait´e. Cependant, les donn´ees ex-p´erimentales et leurs incertitudes limitent le nombre de param`etres de mouvement accessibles. En effectuant un jeu de mesures des trois constantes R₁, R₂ et σ_IS, on calcule directement le

17

http://www.ibs.fr/ext/labos/LRMN/softs/

18http://cpmcnet.columbia.edu/dept/gsas/biochem/labs/palmer/software/modelfree.html

triplet J (0), J (ωN) et J (ωH). Le mod`ele ´etendu, qui fournit le plus de renseignements, pourrait intuitivement ˆetre appliqu´e automatiquement mais il faut valider la signification physique des param`etres extraits. Il faut donc trouver le mod`ele d´ecrivant suffisamment les donn´ees mais sans leur faire dire plus de choses qu’elles ne contiennent,

En g´en´eral, lorsqu’un ph´enom`ene physique peut r´epondre de plusieurs mod`eles th´eoriques, on utilise les statistiques pour d´eterminer quel mod`ele est valide et lequel permet d’expliquer le ph´enom`ene en introduisant un minimum de param`etres. On peut toujours ajouter un pa-ram`etre ajustable mais le nouveau param`etre n’a plus statistiquement de sens. Pour cela, on estime la probabilit´e qu’un mod`ele satisfasse `a l’exp´erience par la d´etermination d’une fonction cible χ² : χ² = N X i=1 (V_{i, calc}− V_{i, exp})² σ2 i, exp (5.17) avec N : nombre de points, V_i : valeur exp´erimentale ou calcul´ee, σ_{i, exp} : incertitude sur la

mesure

La grandeur χ2, ne d´ependant pas du nombre de param`etres, d´ecrit la distance entre les valeurs exp´erimentales et les valeurs calcul´ees `a partir du mod`ele. Plus il est faible, plus l’exp´ e-rience est d´ecrite de fa¸con correcte par le mod`ele. L’ad´equation d’un mod`ele est alors ´evalu´ee soit par un test du χ2 o`u le minimum de χ2 est ´evalu´e en fonction du nombre de param`etres du mod`ele, soit par Monte-Carlo. L’ajout d’un param`etre diminue automatiquement le χ2

au-del`a d’une valeur statistiquement significative, compte tenu des erreurs exp´erimentales. La d´etermination de cette limite, et donc du mod`ele qui sera choisi en fin d’algorithme, est gou-vern´ee par la statistique du F, qui valide l’ajout statistiquement significatif d’un param`etre par rapport au nombre de variables et aux erreurs exp´erimentales.

La premi`ere ´etape de la proc´edure consiste `a partir du mod`ele le plus simple. On d´etermine les param`etres ajustables en minimisant la fonction χ2 par l’algorithme Levenberg-Marquardt. L’erreur sur les param`etres est obtenue par une simulation Monte-Carlo : on g´en`ere un jeu de donn´ees pseudo-exp´erimentale `a partir des donn´ees mesur´ees et de l’incertitude de la mesure (on fait l’hypoth`ese d’une distribution normale), on calcule ensuite les param`etres correspon-dants `a ce jeu de donn´ees. L’erreur sur les param`etres ajust´es est calcul´ee sur la base de la distribution des param`etres ainsi recalcul´es. Chaque jeu de donn´ees al´eatoires correspond alors `

a un χ2

th. Le mod`ele est jug´e acceptable dans un intervalle de confiance de 95% si 5% des χ2 th

est sup´erieur `a χ²_exp.

On applique ensuite cette m´ethode successivement aux autres mod`eles jusqu’`a ce que le mod`ele soit acceptable dans un intervalle de confiance de 95% et que la statistique des F indique que l’ajout d’un param`etre n’est pas statistiquement justifi´e.

Il faut noter que les mod`eles 4 et 5 ont trois param`etres ajustables, le syst`eme n’a plus de degr´e de libert´e interne et le test-F ne peut ˆetre utilis´e. Ces mod`eles sont accept´es dans la mesure o`u le χ<sup>2</sup> est suffisamment proche de z´ero. Dans le cas contraire, Tensor2 (ou modelfree) rejette les cinq mod`eles mais propose tout de mˆeme les valeurs de mobilit´e du meilleur des cinq mod`eles.

Il faut noter que les mod`eles 2 et 3 sont math´ematiquement tr`es proches et le choix entre l’introduction du terme d’´echange ou d’un temps de corr´elation τ_e peut s’av´erer discutable. Si l’un des deux mod`eles est choisi, cela traduit simplement que l’ajustement des donn´ees n´ecessite

5.1. ´El´ements de th´eorie 115 un terme suppl´ementaire, qui peut correspondre physiquement soit `a de la dynamique interne rapide importante, soit `a de la pr´esence d’´echange chimique. Les exp´eriences de type CPMG permettent de lever en partie l’ambigu¨ıt´e.

Les logiciels donnent en sortie apr`es analyse un fichier contenant le mod`ele choisi, la valeur de χ2 minimal, S2

f, S2

s, τ_e (τ_s pour le mod`ele 5), R<sub>ex</sub> ainsi que les incertitudes associ´ees pour chaque r´esidu. La colonne PO du fichier de sortie de Tensor2 correspond `a S2

s et la colonne P 1 `a S_f². S² se d´eduit par la relation : S² = S_f²S_s².

D´etermination de τ_c Le lecteur aura remarqu´e que le temps de corr´elation global τ_c n’est pas utilis´e ici comme un param`etre ajustable. Il est extrait pr´ealablement du rapport R<sub>2</sub>/R<sub>1</sub>sur les r´esidus pr´esentant le moins de flexibilit´e (situ´es a priori dans les structures secondaires) et non impliqu´es dans un ph´enom`ene d’´echange chimique (Clore et al. [1990a], Lee et al. [1997]). En effet, en consid´erant que pour ces r´esidus, le temps de corr´elation des mouvements rapides (τ_e) est n´egligeable, la fonction de densit´e spectrale se r´eduit `a :

J (ω) = ^S

2τ_c 1 + ω2τ2

c

(5.18) Le rapport R₂/R₁ ne d´epend alors plus de τ_e, ni de S2.

Une simulation Monte-Carlo ´evalue l’incertitude sur τ_c et valide ´egalement si le mod`ele de rotation globale isotrope est acceptable dans l’intervalle de confiance de 95%. Si le mod`ele de rotation isotrope est valable, alors le temps de corr´elation τ_c est suppos´e identique pour tous les r´esidus, mˆemes ceux pr´esentant une forte mobilit´e ou/et de l’´echange. On notera que si la r´eorientation de la prot´eine n’est pas isotrope, il faut prendre en compte 3 temps de corr´elation pour d´efinir le tenseur de diffusion orientationnelle. La valeur de τ_c calcul´ee pour un r´esidu par le rapport R₂/R₁ d´epend alors de l’orientation du vecteur. Ainsi, hors ´echange chimique et dynamique interne importante, de grandes variations de ce rapport au sein de la s´equence indiquent une r´eorientation anisotrope. Ceci est particuli`erement visible pour une structure dont les h´elices α pointent dans des directions tr`es diff´erentes.

La valeur de τc calcul´ee est `a mettre en lumi`ere avec celle d´eriv´ee de l’´equation d’hydrody-namique de Stoke-Einstein (5.19) associ´ee `a une mol´ecule sph´erique de volume V (Palmer III [1996]). τ_c = ^η ∗V kBT ^(5.19) avec V = ^M_ρ(l.mol⁻¹) = _6,02.10¹⁰²¹23 M ρ(nm³)

η^∗ : viscosit´e du milieu, k_B : constante de Boltzmann, T : temp´erature

On consid`ere en g´en´eral qu’une prot´eine dispose `a sa surface d’une monocouche d’hy-dratation de 0,32nm. Le volume sp´ecifique de la prot´eine est 0, 73cm³/g. De la masse de la prot´eine, on calcule son volume. Le volume est ensuite corrig´e pour tenir compte de la couche d’hydratation (Palmer III [1996]).

Pour estimer la viscosit´e de l’eau `a diff´erentes temp´eratures, j’ai utilis´e la relation suivante (Atkins [1982]) : log η₂₀ η_T  = ^{1, 37023(T◦C}− 20) + 8, 36.10−4(T◦C − 20)2 109 + T◦C (5.20)

Fig. 5.5: S´equence d’impulsions pour la mesure de R₁. Les impulsions sont par d´efaut sui-vant l’axe x. Le cyclage de phases est le suisui-vant :φ₁ = x, −x ; φ₂ = x, x, −x, −x ; φ₃ = x, x, x, x, −x, −x, −x, −x ; φacq = x, −x, x, −x, −x, x, −x, x. La d´etection en quadrature dans la dimension indirecte est assur´ee par le States-TPPI.

avec η₂₀ = 10⁻³kg.m⁻¹.s⁻¹ la viscosit´e de l’eau `a 20^◦C

Ceci nous donne donc `a 308K (T = 34, 85<sup>◦</sup>C) une viscosit´e de l’eau pure de η<sub>308K</sub> = 0, 867 ∗ 10<sup>−3</sup>kg.m<sup>−1</sup>.s<sup>−1</sup> et `a 283K, η_283K = 1, 12 ∗ 10⁻³kg.m⁻¹.s⁻¹.