2 Synthèse de la littérature
2.4 Voies de livraison
2.4.2 Stratégies pour la fuite des endosomes
2.4.2.2 Stratégie de fusion des ELDs avec des CPPs
Les CPPs et les ELDs ont été caractérisés séparément au cours de leurs développements respectifs. Les CPPs ont essentiellement été traités pour augmenter la livraison dans les cellules, à savoir l’entrée par endocytose du CPP et de son cargo associé. Les ELDs se retrouvent rarement endocytés seuls, c’est pourquoi un CPP en fusion permet d’amener le peptide jusqu’à sa cible, la membrane endosomale58,291.
Des études ont abordé depuis 2004 (Wadia et al.) l’association d’un CPP avec un ELD, afin de livrer différents types de cargos, protéiques ou nucléiques134. Ce système lié au cargo offre la possibilité d’éliminer les
éléments synthétiques ou viraux de la livraison cellulaire.
2.4.2.2.1 Stratégie de fusion des peptides CPP-ELDs avec les protéines
Plusieurs études ont tenté de livrer un cargo en le liant de manière covalente à un CPP et un ELD. Michiue et al. ont livré la protéine p53 dans des cellules cancéreuses en la fusionnant avec le ELD HA2 et le CPP 9R (9 arginines)292. La comparaison de la présence ou absence de HA2 a permis de démontrer sa fonction de fuite
des endosomes en livrant la protéine GFP. Koshman et al. ont livré des points quantiques en les associant à TAT-HA2 via un pont disulfure293. Ces cargos ont été visualisés par microscopie au niveau périnucléaire de
fibroblastes et de myocytes. La fuite des endosomes est montrée incomplète en raison d’un signal vésiculaire, mais les cargos ont aussi été observés dans les noyaux des myocytes. Dans ce dernier cas, la liaison entre le cargo et le CPP-ELD a été réalisée via un pont disulfure, qui doit rester intègre jusqu’à la fuite des endosomes. Les conditions réductrices du cytoplasme permettent alors de séparer le cargo du peptide294. En
2009, Glover et al. ont mis en place un système multi-domaines comprenant un CPP et un ELD afin de livrer de l’ADN plasmidique (Figure 6). Le but de cette construction était de réaliser toutes les étapes de livraison d’un cargo nucléique. La liaison avec l’ADN se faisant via un domaine de liaison à l’ADN.
Figure 6 - Stratégie d'un agent protéique multi-domaines (Glover et al. 2009)
Seule la toxine diphtérique (DT) a été étudiée comme domaine de fuite des endosomes, et α-MSH comme domaine de pénétration cellulaire. Ces agents ont été obtenus par expression dans des bactéries E. coli et purifiés via une séquence de 6 histidines. Ils ont permis la dégradation de liposomes à pH acide (simulant l’environnement endosomal), puis la livraison d’ADN dans des cellules HEK293 et B16-F1. Des ratios entre ADN et agents ont été déterminés suivant un rapport entre les charges d’arginines et de nucléotides (Arg/Nu). Dans des cellules dont le cycle cellulaire a été stoppé (pas de division), ces agents présentent une efficacité de transfection supérieure au PEI.
Le potentiel d’association d’un CPP avec un ELD a été mis à l’épreuve plus récemment par Liou et al., avec la livraison d’une protéine fluorescente (RFP)295. Les agents produits en tant que protéines recombinantes
associaient le cargo à livrer aux éléments CPP et ELD, avec ou sans domaine d’importation nucléaire (Nuclear Localization Signal, NLS). Ainsi, le ELD INF-7 a été associé au CPP 9R, ainsi qu’au NLS SV40. Les livraisons de la protéine fluorescente ont alors donné des rendements et localisations cellulaires variables tel que mesurés par cytométrie de flux et par microscopie à fluorescence, comme on peut notamment le voir dans la Figure 7.
Figure 7 - Livraison de CPP-ELD-NLS-protéine (Liou et al. 2012)
La protéine simplement associé à R9 avait déjà été visualisée par cette équipe comme endosomale296. Après
24 heures d’incubation, la protéine est observée légèrement diffuse dans la cellule, avec également des signaux membranaires et vésiculaires, qui correspondraient à une livraison incomplète de la protéine.
Lönn et al. ont livré la protéine GFP en fusion avec le domaine de pénétration cellulaire TAT, et également en fusion avec divers domaines susceptibles de permettre la fuite des endosomes252. Cette étude a comparé
plusieurs variations du domaine de fuite des endosomes, et réalisé doses-réponses avec une réponse de livraison associée à la viabilité. En 2017, une étude a ajouté un domaine permettant la fuite des endosomes (S19) d’une protéine de fusion GFP-TAT, avec des résultats de livraison améliorés297.
Jusqu’aujourd’hui, l’association d’un CPP et d’un ELD fusionnés à un cargo protéique à livrer dans les cellules de mammifère a abouti à des rendements de livraison prometteurs mais à encore améliorer. De nombreuses raisons peuvent expliquer les faibles rendements. Tout d’abord un cargo protéique fusionné à ces peptides spécialisés demande à être produit de manière recombinante, que ce soit en bactéries ou autres systèmes d’expression. La purification peut être très complexe en raison des acides aminés chargés ou hydrophobes. De plus, des endotoxines dues à la production en bactéries peuvent affecter les livraisons et a toxicité sur les cellules. Enfin, une séquence de fuite des endosomes ELD présente toujours une affinité pour les membranes cellulaires. Si le cargo est fusionné au domaine ELD, ce dernier fait office d’ancrage du cargo dans les endosomes, empêchant la fuite des endosomes malgré la déstabilisation membranaire58. Les stratégies visant
à dissocier le ELD du cargo permettent de déjouer ce problème.
2.4.2.2.2 Co-incubation de peptides CPP-ELDs avec les protéines
incompatible à la livraison efficace de ce cargo, puisque le complexe restera associé à l’endosome, même après avoir altéré la membrane endosomale. Cette étape de fuite des endosomes d’un cargo peut être réalisée en ajoutant un complexe de fusion indépendant CPP-ELD en simple co-incubation. Il reste alors à vérifier s’il est nécessaire que le cargo soit lié de manière covalente à un CPP pour se rendre jusqu’aux endosomes, ou si le complexe CPP-ELD peut faire intervenir des liaisons faibles avec le cargo pour réaliser toutes les étapes de la livraison cellulaire. Des études réalisées sur quelques complexes CPP-ELDs ont montré une amélioration significative comparativement aux premières études de livraison protéique par CPPs. Ayant fait la preuve que la protéine recombinase Cre, en fusion avec TAT, pénètre les cellules par macropinocytose et y reste bloqué, Wadia et al. ont cherché à provoquer la fuite des endosomes en apportant un peptide TAT-HA2 en co-incubation134.
Figure 8 - CPP-ELD pour la livraison de TAT-Cre (Wadia et al. 2004)
Comme montré dans la Figure 8, TAT-Cre aboutit à un faible niveau de recombinaison des cellules NIH/3T3, avec le besoin d’atteindre de plus hautes concentrations de protéine. La co-incubation de TAT-HA2 et TAT- Cre permet l’obtention de plus de 70% de recombinaisons, avec une plus faible concentration de TAT-Cre nécessaire. Pour obtenir un effet similaire, il a été nécessaire d’ajouter une concentration trop toxique. Il est à noter que le peptide TAT-HA2 est dans cette étude composé d’acides aminés de configuration D. Ce type d’acides aminés est notamment retrouvé dans certains peptides antimicrobiens, et permettent une meilleure résistance aux protéases. Ils ont d’ailleurs été utilisés pour augmenter la stabilité de peptides antimicrobiens et de CPPs298,299.
Cette stratégie d’apporter l’élément responsable de la dégradation des membranes endosomales via un CPP indépendant au cargo a depuis été reprise par quelques études. Sugita et al. ont livré le peptide anti-tumoral shepherdine fusionné à TAT300 en co-incubation HA2-TAT134,301. Sugita et al. ont tout d’abord démontré le
passage des endosomes vers le cytoplasme d’un fluorochrome FITC fusionné à TAT. Les résultats présentés dans la Figure 9 montrent la localisation endosomale d’un cargo ayant la stratégie d’être fusionné à un CPP (photo de gauche), et la différence avec une stratégie de déstabilisation des endosomes via le HA2-TAT (photo de droite). De plus, le HA2-TAT n’augmente pas la quantité de cargo FITC situé à l’intérieur de la cellule (comme le montre le graphique), mais augmente la quantité de cargo FITC dans le cytoplasme.
Figure 9 - Fuite des endosomes d'un cargo endocyté provoquée par HA2-TAT (Sugita et al. 2007) Dans le graphique suivant de Sugita et al. (Figure 10), on peut voir que la shepherdine seule ne peut effectuer son activité anti-tumorale. Une activité est observée avec la fusion avec TAT. De plus, l’ajout de HA2-TAT permet une meilleure activité de la shepherdine-TAT, synonyme de plus de cargo livré au compartiment cellulaire souhaité. Le point critique est apporté sur le fait que le HA2-TAT ne permet pas à la shepherdine non-fusionnée à un CPP de réaliser son activité, émettant l’hypothèse d’une absence d’interaction entre la navette et le cargo.
Figure 10 - Livraison d'un CPP-cargo en co-incubation avec HA2-TAT (Sugita et al. 2007)
Les peptides HA2-TAT de Sugita et al. ont été synthétisés avec des acides aminés de configuration L, contrairement à Wadia et al., validant l’intérêt de cette stratégie sans la nécessité d’une configuration D. La conclusion de cette étude sur la stratégie du peptide de fusion de domaines CPPs et ELDs est qu’il ne peut pas réaliser la livraison d’un cargo à l’état natif. Il est a priori nécessaire de livrer un cargo au préalable jusqu’au système endosomal.
Sugita et al. ont poursuivi leurs études de livraison de cargos fusionnés à un CPP en réalisant une étude comparative de quatre CPPs associés à un cargo type fluorescéine157. Comme lors de leur étude précédente,
Sugita et al. ont employé HA2-TAT pour faire passer les CPP-cargos depuis les vésicules endosomales vers le cytoplasme. Les rendements des quatre CPPs en termes de livraison et de toxicité dans plusieurs lignées cellulaires sont cependant restés limités. Cette stratégie n’a été utilisée par Sugita et al. que pour démontrer que les CPPs comparés livrent le cargo dans les mêmes vésicules que TAT, puisque la fuite des endosomes est provoquée par le CPP-ELD contenant TAT. Cette méthode a donc servi ici de moyen d’étude des mécanismes en jeu. La présence de quelques vésicules marquées malgré la diffusion du signal dans le cytoplasme par le CPP-ELD est interprétée dans cet article comme la présence d’autres voies de livraison pour les CPPs autres que TAT. Néanmoins, il est logique de supposer également que la fuite des endosomes peut rester incomplète dans plusieurs cellules malgré HA2-TAT, ou que le cargo reste en partie lié à la membrane endosomale en raison de sa fusion avec un CPP ayant une affinité pour les membranes. La même année, cette équipe a livré le cargo TAT-VENUS (cargo protéique fluorescent) en fusion avec SV40 dans des cellules HeLa302. L’ajout de HA2-TAT a permis le passage d’un signal ponctué dans les cellules en
microscopie à fluorescence, à un signal diffus dans le noyau, signifiant la fuite des endosomes puis l’importation nucléaire du cargo. Cette étude indique que l’ajout de fonctions supplémentaires pour le destin du
cargo est possible via l’ajout de peptides spécialisés comme ici un NLS. Si un cargo nécessite d’être dans le noyau pour réaliser son activité biologique et qu’il ne peut s’y rendre seul depuis le cytoplasme, un NLS peut augmenter l’activité observée. Yoshikawa et al. ont obtenu dans cette étude une meilleure activité de la protéine pro-apoptotique NLS-PM10-TAT que PM10-TAT.
La stratégie de l’emploi d’un CPP-ELD n’est pas spécifique à la livraison de cargos protéiques uniquement. En effet, des études ont été menées pour la livraison d’ADN, de siRNA et d’acides nucléiques peptidiques (ANP)303. Il est intéressant de traiter cette partie de la littérature des CPP-ELDs en raison des travaux sur la
fuite des endosomes. Pour la livraison d’ANP, El-Andaloussi et al. ont associé le cargo à trois différents CPPs (TAT, pénétratine et transportane) via un pont disulfure afin de provoquer l’endocytose du complexe formé304.
Ils ont constaté que l’addition d’agents pouvant dégrader des vésicules lysosomales ou endosomales à leurs systèmes améliorait l’efficacité de leur cargo. Les deux agents étaient la drogue chloroquine et HA2- Pénétratine. L’activité du cargo a pu être améliorée via la présence du CPP-ELD. Cette augmentation est soupçonnée d’être due à une fuite des endosomes plus efficace.
La livraison d’acides nucléiques via les CPP-ELDs ajoute une étape de liaison entre le cargo et la navette protéique. Cette liaison fait intervenir les charges négatives de l’acide nucléique et les charges positives des CPPs. Lundberg et al. ont développé un CPP hybride tiré de la pénétratine, EB1, pour livrer des siRNA dans des cellules de mammifères182. La pénétratine a été modifiée pour y incorporer deux histidines, afin de
conférer une dépendance du pH pour la capacité à déstabiliser les membranes endosomales. Lundberg et al. ont alors comparé la livraison de siRNA entre différents CPPs et EB1, et également avec HA2-Pénétratine. Le but de ce peptide était de conférer une fonction de fuite des endosomes de la pénétratine par l’ajout d’un ELD. Le complexe pénétratine-siRNA co-incubé avec HA2-pénétratine a permis une inhibition significative, alors que la pénétratine seule ne permet aucune fonction du siRNA. La fuite des endosomes peut donc être réalisée par les CPP-ELDs pour d’autres types de cargos que des protéines, tant que leur interaction est réalisée au préalable. Il est à noter qu’une meilleure efficacité des siRNA a été obtenue avec la livraison via EB1. Cela indique la possibilité pour un peptide de livraison indépendant du cargo d’effectuer toutes les fonctions de livraison (interaction avec le cargo, pénétration cellulaire, fuite des endosomes). Un tel peptide ayant une affinité pour les membranes n’empêche donc pas la dissociation du cargo et l’ancrage dans les membranes endosomales.
Lee et al. ont cherché à développer des CPP-ELDs afin de livrer des macromolécules ne présentant pas de CPP fusionné172. Le but était d’éviter la fusion d’un CPP au cargo qui pourrait affecter l’activité ou la
après avoir été micro-injectée. L’intérêt est donc de livrer une macromolécule à l’état natif afin de ne pas la diriger vers un compartiment cellulaire non-visé.
Les peptides développés par Lee et al. sont dérivés de HA2-TAT, avec la variation du HA2 en E3 ou E5, qui sont des peptides présentant une meilleure déstabilisation de membranes lors de tests sur des liposomes305.
Comme pour les études précédentes, ces peptides ont été obtenus par synthèse, mais ces peptides ont dû être resuspendus dans du DMSO afin d’éviter la formation de précipités. E5-TAT présentait la meilleure lyse de liposomes avec une baisse du pH en-dessous de 7, ainsi qu’un seuil de concentration à pH 4 plus faible qu’à pH 7, permettant de valider la dépendance au pH du peptide et la fonction de celui-ci uniquement dans les endosomes, pour ne pas dégrader la membrane plasmique.
Pour étudier la possible interaction entre le peptide de livraison et le cargo natif à livrer, Lee et al. ont réalisé des gels natifs, comme on peut le visualiser en Annexe 4. Comme Sugita et al. l’ont suggéré, il ne semble pas y avoir d’interaction entre la navette et le cargo protéique. TAT présente une faible interaction avec la BSA ou mCherry, alors que E5-TAT n’en présente aucune. Cette étude conclut avec prudence une absence d’interaction significative, soulevant de nouveau la nécessité de livrer le cargo via un CPP pour que le peptide CPP-ELD remplisse sa fonction de fuite des endosomes.
L’étude de JP. Pellois propose un large éventail de cargos protéiques et de dextranes (mCherry, MBP- mCherry, EGFP, tdTomato, dextranes de 10 et 70 kDa marqués à la fluorescéine ou TexasRed), livrés avec E5-TAT (Figure 11).
Figure 11 - Rendements de livraison de mCherry par E5-TAT (Lee et al. 2010)
E5-TAT permet la livraison de mCherry de manière diffuse (cytoplasmique) dans 15% de cellules HeLa, via une interaction entre TAT et les héparane sulfate proteoglycanes (prouvée via l’héparine), et via l’endocytose (prouvée par l’absence de livraison à +4°C) et la fuite des endosomes (prouvée par l’absence de diffusion en présence de bafilomycine). E5-TAT permet autant de livraison de mCherry que E3-TAT et TAT, mais avec une livraison jusqu’au cytoplasme plus efficace.
La triple-fonction d’un CPP-ELD pour la livraison d’un cargo natif est schématisée dans la Figure 12. Elle comprend : (1) l’interaction éventuelle entre le CPP-ELD et le cargo à livrer, (2) le déclenchement de l’endocytose du cargo dans la cellule de mammifère, et (3) la fuite des endosomes du cargo vers le cytoplasme avant sa dégradation.
Figure 12 - Stratégie des CPP-ELDs (Lee et al. 2010)
Ces articles, publiés entre 2004 et 2012, présentent la stratégie des CPP-ELDs pour la livraison de différents cargos vers les cellules de mammifères. HA2-TAT a été modifié afin d’améliorer la livraison de ces cargos. En effet, trois CPPs ont été utilisés : TAT, pénétratine et R9. Le domaine ELD n’a varié que de HA2 à E3 et E5, sachant que ces deux derniers sont des variations de HA2. HA2 a été grandement étudié en cherchant à exploiter les mécanismes viraux pour développer des solutions non-virales. Cette stratégie des CPP-ELDs a été présentée en revue bibliographique pour la première fois en 2009, puis en 2012 par JP. Pellois qui a travaillé sur HA2-TAT et ses analogues58,306,307. On peut citer quelques études ayant fait varier de manière
plus significative la stratégie des CPP-ELDs libres, essentiellement après 2010. En 2008, Lo et Wang ont cherché à modifier le TAT en y fusionnant des éléments pour améliorer la fuite des endosomes242. En effet,
TAT ne comporte pas d’acides aminés changeant de charge en passant du pH extracellulaire au pH endosomal308. Ils y ont donc fusionné plusieurs histidines, créant un agent à deux domaines : TAT comme
CPP, et 10H (10 histidines consécutives) comme agent de fuite des endosomes. Par effet d’éponge à protons, les histidines ont permis la livraison d’ADN plasmidique194,309. Lo et Wang ont également incorporé des
cystéines pour dimériser ces TAT-10H, afin d’améliorer l’interaction avec le cargo nucléique jusqu’au cytoplasme. Une autre variation importante des CPP-ELDs a été effectuée entre 2012 et 2014. Salomone et al. ont cherché à changer le peptide de fuite des endosomes HA2 par CM18218. Depuis les premiers travaux
séquestrée dans les endosomes, malgré le co-traitement avec HA2-TAT134,135. HA2 étant un peptide de fuite
des endosomes du virus de l’influenza, il est responsable de la fusion entre son enveloppe et la membrane endosomale, permettant de libérer son contenu dans le cytoplasme231,310,311. Ce peptide a donc un
mécanisme principalement de fusion, même si d’autres mécanismes comme la déstabilisation des membranes peuvent être inclus58. Ce constat peut expliquer les rendements insuffisants de ce peptide pour les stratégies
de cargos sans enveloppe lipidique. Il est donc nécessaire de choisir un peptide de fuite des endosomes privilégiant la déstabilisation des membranes endosomales ou la formation de pores pour concevoir un CPP- ELD efficace. Ce type de peptide a déjà été proposé en co-incubation avec un peptide lié au cargo312,313.
Salomone et al. ont conçu un peptide pour livrer de l’ADN plasmidique, mais également d’autres cargos. Le domaine de fuite des endosomes sélectionné était CM18, un peptide chimérique résultant d’une fusion entre des fragments de cécropine et de mélittine288,314–316. CM18 fait partie d’une classe de domaines ELDs
caractérisés comme des hélices alpha antimicrobiennes, chargés positivement. Ce peptide amphiphile (partie N-terminale hydrophile de la cécropine et partie N-terminale hydrophobe de la mélittine) est soluble et prend