Méthodes

Culture cellulaire

Les cellules HeLa et THP1 ont été obtenues de ATCC - American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), et mises en culture selon les recommandations du fournisseur.

Production et purification de protéines de fusion

Les protéines de fusion GFP, GFP-NLS, TAT-GFP, Pénétratine-GFP, CM18-TAT-GFP et CM18-Pénétratine- GFP ont été produites en bactéries E. coli BL21DE3 via un vecteur contenant un promoteur T5, et l’induction par isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Le milieu de culture était composé de 24 g d’extrait de levure, 12 g de tryptone, 4 mL de glycerol, 2.3 g de KH2PO4, et de 12.5 g K2HPO4 pour un litre. Les bactéries ont été mises en culture dans le milieu décrit à 37°C et sous agitation, en présence d’ampicilline pour la conservation du plasmide contenant un gène de résistance contre l’antibiotique. L’induction des bactéries a été effectuée lors de l’obtention d’une DO (densité optique) à 600 nm comprise entre 0.5 et 0.6, avec 1 mM d’IPTG et une baisse de la température d’incubation à 30°C. Après 3 heures de culture, les bactéries ont été récupérées par centrifugation (5000 RPM) puis conservées à -20°C. Les culots ont été suspendus dans un

tampon Tris (Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 100mM, imidazole 5 mM) avec 1 mM de phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), et les bactéries ont été lysées pars un homogénéiseur Panda 2KTM (1000 bars, 3 fois). Une centrifugation a ensuite été réalisée (15000 RPM, 4°C, 30 minutes) et les surnageants filtrés à 0.22 μm. Les protéines solubilisées, contenues dans les surnageants filtrés, ont été purifiées tout d’abord par chromatographie d’affinité (FPLC AKTA Explorer 100R, colonne HisTrapTM FF). La colonne a au préalable été équilibrée par 5 volumes de colonne (VC) de tampon Tris. Une fois les protéines passées dans la colonne, cette dernière a été lavée par 30 VC de tampon Tris et 30 VC de tampon Tris avec 40 mM d’imidazole. L’élution des protéines a été réalisée avec 5 VC de tampon Tris avec 350 mM d’imidazole. Les fractions contenant les protéines ont été déterminées par gel dénaturant SDS-PAGE. Les protéines purifiées ont alors été diluées dans 20 mM de Tris avec un pH adapté par rapport au pI de la protéine. Une colonne d’échange d’ions (Q SepharoseTM ou SP SepharoseTM) a été équilibrée par 5 VC de 20 mM de Tris et 30 mM de NaCl. La colonne a été lavée avec 10 VC de 20 mM de Tris et 30 mM NaCl. Une fois les protéines passées dans la colonne, cette dernière a été lavée par de 20 mM de Tris et 30 mM NaCl. L’élution des protéines a été réalisée par un gradient de NaCl atteignant une concentration de 1 M après 15 VC. Les fractions contenant les protéines ont été déterminées par gel dénaturant SDS-PAGE. Les protéines purifiées ont ensuite été mises dans du tampon PBS 1X à leur concentration finale par changement de tampon (Amicon UltraTM centrifugal filters 10,000 MWCO). La concentration en protéines totales a été évaluée par un test standard Bradford. En cas de niveau de contaminants types endotoxines trop élevé (>100 EU/mg), les protéines ont été purifiées par une colonne d’héparine (20ml FF - 5-10°C) avec un lavage de 20 VC de 2 M de NaCl avant d’être éluées.

Test de niveau d’endotoxines LAL

Le niveau d’endotoxines a été évalué en diluant les protéines recombinantes purifiées dans l’eau et agitées par vortex plusieurs fois pendant 1 minute. Du limule amoebocyte (BioLynx Inc. #SKC00315) et une solution standard d’endotoxines (E. Coli 0113:H10) (BioLynx Inc. #SKE0005) ont été utilisés pour évaluer le niveau d’endotoxines de l’échantillon par spectrophotométrie.

Livraison de protéine recombinante GFP et ses constructions dérivées en cellules HeLa

Un jour avant le test de livraison de protéines, les cellules ont été récoltées par trypsinisation et mises en plaques multipuits (20 000 cellules pour une plaque 96-puits ou 200 000 cellules pour une plaque 24-puits). Les cellules ont été incubées jusqu’au lendemain dans un milieu de culture avec du sérum (selon la composition recommandée par le fournisseur).

Le jour du test de livraison, les protéines ont été mises à leur concentration de livraison par dilution dans du milieu sans sérum (DMEM) ou du tampon PBS 1X suivant le protocole employé, le tout dans un volume suffisant pour recouvrir totalement les cellules durant le temps de livraison (de 15 à 100 µL en plaque 96-puits et 200 µL en plaque 24-puits). Dans le cas de livraison par co-incubation, les peptides ont été dilués au préalable dans de l’eau purifiée, puis le PBS 1X ou milieu sans sérum a été ajouté avec par la suite la protéine GFP à livrer. Des conditions contrôles ont été utilisées, les cellules non-traitées, un contrôle en présence de GFP ou GFP-NLS incapable d’entrer dans les cellules. Dans le cas de livraison par co-incubation, des contrôles ne contenant que le peptide CPP, ELD ou CPP-ELD ont été utilisés. Avant la livraison, les cellules ont été lavées au tampon PBS 1X (100 µL en plaque 96-puits et 500 µL en plaque 24-puits) à 37°C. Les solutions contenant les protéines à livrer ont ensuite été déposées sur les cellules, avec un temps d’incubation variable, à 37°C. A la fin de du temps de livraison, du milieu avec sérum a été ajouté (100 µL en plaque 96- puits et 500 µL en plaque 24-puits), et le volume total a été retiré, et les cellules ont été lavées plusieurs fois avec du tampon PBS 1X (1 à 3 fois selon le besoin). Enfin, du milieu de culture avec sérum (37°C) a été ajouté et les cellules étaient disponibles pour analyse.

Livraison de protéine recombinante GFP et ses constructions dérivées en cellules THP1

Un jour avant le test de livraison de protéines, les cellules ont été récoltées et mises en plaques multipuits (20 000 cellules pour une plaque 96-puits). Les cellules ont été incubées jusqu’au lendemain dans un milieu de culture avec du sérum (selon la composition recommandée par le fournisseur).

Le jour du test de livraison, les protéines ont été mises à leur concentration de livraison par dilution dans du milieu sans sérum (DMEM) ou du tampon PBS 1X suivant le protocole employé., le tout dans un volume 50 µL. Dans le cas de livraison par co-incubation, les peptides ont été dilués au préalable dans de l’eau purifiée, puis le PBS 1X ou milieu sans sérum a été ajouté avec par la suite la protéine GFP à livrer. Des conditions contrôles ont été utilisées, soient les cellules non-traitées, et un contrôle en présence de GFP ou GFP-NLS incapable d’entrer dans les cellules. Dans le cas de livraison par co-incubation, des contrôles ne contenant que le peptide CPP, ELD ou CPP-ELD ont été utilisés. Avant la livraison, le milieu de culture a été retiré après centrifugation (400 g, 2 minutes) et retrait du surnageant, puis les cellules ont été lavées au tampon PBS 1X (100 µL en plaque 96-puits et 500 µL en plaque 24-puits) à 37°C en resuspendant le culot de cellules. Après centrifugation et retrait du surnageant, les solutions contenant les protéines à livrer ont servi à resuspendre le culot cellulaire, puis laissées selon un temps d’incubation variable, à 37°C. Après, du milieu avec sérum a été ajouté (100 µL) puis les cellules ont été de nouveau centrifugées. Les cellules ont été lavées avec du tampon PBS 1X par la resuspension du culot cellulaire et une nouvelle centrifugation. De la tryspine / EDTA a été ajoutée pour éliminer la GFP potentiellement présente sur les membranes (50 µL diluée 1/10 dans PBS 1X, 2

minutes) et inactivée par ajout de milieu avec sérum (100 µL). Les cellules ont de nouveau été lavées au PBS 1X (avec centrifugation). Enfin, du milieu de culture avec sérum (37°C) a été ajouté et les cellules étaient disponibles pour analyse.

Microscopie à fluorescence

La livraison de protéines fluorescentes contenant la GFP a été évaluée qualitativement par microscopie à fluorescence. Un microscope IX70TM de Olympus, équipé avec une lampe U-LH100HGAPO et différents filtres, a été utilisé. Le filtre Olympus U-MF2TM (C54942-Exc495/Em510) a été utilisé pour observer la GFP (vert). Le filtre Olympus HQ-TRTM (V-N41004-Exc555-60/Em645-75) a été utilisé pour visualiser le LysoTracker Red pour le marquage des endosomes et lysosomes (rouge). Le filtre Olympus U-MWU2TM (Exc330/Em385) a été utilisé pour visualiser le Hoechst pour le marquage nucléaire (bleu). Les grossissements des objectifs employés allaient de 4X à 40X. Les images ont été acquises par une caméra CoolSNAP-PRO (A02D874021) et le logiciel Image-Proplus.

Cytométrie de flux

La livraison de protéines fluorescentes contenant la GFP a été évaluée quantitativement par cytométrie de flux. Un cytomètre Accuri C6 de Becton, Dickinson and Company (BD) a été utilisé. Les cellules non-traitées (contrôle négatif) ont permis de placer la limite de signal de fluorescence au-delà de laquelle les cellules seront considérées comme positives à la GFP, cette dernière ayant pénétré dans les cellules. La moyenne du signal fluorescent, ou le pourcentage de cellules présentant un signal supérieur à la limite établie, ont permis d’évaluer l’entrée de GFP dans les cellules. Les évènements analysés par le cytomètre sont caractérisés par une taille (FSC) et une granulosité (SSC), permettant de sélectionner ceux correspondant aux cellules. La toxicité cellulaire était estimée par la comparaison des FSC et SSC de l’échantillon avec ceux de la condition de cellules non-traitées, aboutissant à un pourcentage approximatif de viabilité.

Peptides synthétiques

Les peptides CPPs, ELDs et CPP-ELDs ont été obtenus synthétiquement par le fournisseur GLBiochem (Shanghai, Chine). Le niveau de pureté minimal était de 95%, validé par HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance - high-performance liquid chromatography), et le poids moléculaire souhaité a été confirmée par spectrométrie de masse.

4 Membrane permeabilizing amphiphilic peptide