Analyse des structures prédites

Les structures des domaines de pénétration et de fuite des endosomes sont aussi décrites dans la littérature comme critiques pour réaliser leurs fonctions. Certains de ces peptides, en plus de leur charges et hydrophobicité permettant l’interaction avec les membranes, peuvent prendre des structures particulières, en solution ou dans les membranes cellulaires. Certains CPPs et ELDs acquièrent un caractère amphiphile via la formation d’une hélice alpha (le domaine KALA par exemple)483_.

Dans l’objectif d’étudier les structures possibles des CPP-ELDs, l’outil de prédiction PEP-FOLD3 a été utilisé (disponible à l’adresse suivante : http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms::PEP-FOLD3). Cet outil vise à prédire les structures de peptides de novo, qui permet la détermination de conformations de séquences de 5 à 50 acides aminés484,485_{. Les peptides CPP-ELDs, ainsi que les contrôles CPPs et ELDs, ont}

été analysés par PEP-FOLD3 puis visualisés avec le logiciel PdbViewer. Dans l’hypothèse d’une hélice alpha, une projection de l’hélice a été réalisée via un outil disponible sur internet, fournissant également le moment hydrophobe obtenu pour une hélice alpha complète (disponible à l’adresse suivante : http://rzlab.ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi).

Les peptides CPP-ELDs, ainsi que certains domaines séparés, ont donc été analysés par cette approche. Les structures obtenues sont fournies dans l’Annexe 9. Les structures prédites ont été visualisées par PdbViewer. De plus, les acides aminés ont été colorés selon leur caractère hydrophobe, avec une couleur bleue pour les plus hydrophobes, et orange / rouge pour les hydrophiles. Ces structures sont accompagnées de graphiques présentant la probabilité qu’un acide aminé se place pour la formation d’une hélice alpha (en rouge dans l’histogramme). On peut ainsi constater que la majorité des CPP-ELDs générés présentent une structure probable en hélice alpha. VSVG-PTD4 présente seulement sa portion CPP en hélice alpha, et ce peptide est inefficace dans le criblage effectué. La partie ELD du peptide semble donc nécessiter une structure hélicale pour être efficace. On peut aussi remarquer que des CPP-ELDs comme PTD4-KALA ont une unique hélice qui recouvre les deux portions ELD et CPP. Cependant, une portion séparant les hélices formées par chaque domaine n’empêche pas de réaliser la pénétration cellulaire, comme on peut le voir avec les variants de CM18-PTD4.

La prédiction des hélices alpha pour les portions ELDs et CPPs entraîne une répartition particulière des acides aminés. On constate un rassemblement d’acides aminés de mêmes natures sur un côté de l’hélice, alors que des acides aminés différents sont présents sur l’autre face de l’hélice. Les ELDs KALA, LAH4, C(LLKK)3 et

CM18 présentent des acides aminés hydrophobes sur une face de l’hélice, et des acides aminés hydrophiles et cationiques sur l’autre.

Figure 68 - Analyse PEP-FOLD3 et projection d'hélice alpha de 6His-CM18-PTD4

Analyse de différentes séquences peptidiques pour l’étude de 6His-CM18-PTD4 par PEP-FOLD3 pour la structure secondaire supposée lorsque le peptide est en solution. Visualisation de la structure (gauche) et détermination de la probabilité de formation d’une hélice alpha (graphiques centraux, en rouge) ou d’une structure aléatoire (en bleu). Les séquences ont été mises en hélices aplha (par hypothèse) pour être visualiées en projections d’hélice (à droite) pour étudier la répartition des acides aminés le long de l’hélice.

Comme le montre la Figure 68, CM18 possède une structure prédite plutôt en hélice alpha, avec une glycine au centre défavorable à sa formation. Néanmoins, d’autres analyses (PEP-FOLD2, PSIPRED, Antimicrobial Peptide Database (APD)) privilégient une hélice alpha tout au long du domaine (en Annexe 10). De plus, on peut supposer que la structure secondaire d’un domaine ELD peut varier selon l’environnement membranaire ou non. En supposant une structure complète en hélice alpha, CM18 possède alors un moment hydrophobe de 4.28, PTD4 de 2.44, et CM18-PTD4 de 6.72. Les séquences riches en histidines ont peu de chances de former une hélice alpha étant donné qu’elles sont consécutives. Cette répartition confère donc une amphiphilicité acquise par la structure secondaire du CPP-ELD. Il est possible de visualiser cette amphiphilicité via les projections présentées dans la Figure 69.

Figure 69 - Caractère amphiphile des CPP-ELDs

Séquences de différents CPP-ELD mises en hélices aplha (par hypothèse) pour être visualiées en projections d’hélice (à droite) pour étudier la répartition des acides aminés le long de l’hélice.L’amphiphilicité éventuelle a été recherchée (marquée par une barre rouge). Les résultats de livraison de GFP-NLS par ces CPP-ELD sont renseignés.

Comme le montre la droite de séparation (en rouge), les acides aminés cationiques (pentagones gris) et anioniques (triangles gris) sont majoritairement retrouvés sur une face de l’hélice. Sur l’autre face, on retrouve plus d’acides aminés hydrophobes (losanges verts). Enfin, les alanines, qui favorisent la formation en hélice alpha, sont présentes tout autour de l’hélice (ronds oranges). La zone hydrophobe obtenue par la structure secondaire est plus ou moins importante selon les CPP-ELDs étudiés, qu’on le peut dénommer un cœur hydrophobe, placé sur une portion donnée du peptide. Dans le cas où ce cœur hydrophobe prend une surface importante par rapport à la face cationique, comme JST-PTD4 et Xentry-KALA, le peptide est alors inefficace et généralement peu toxique.

La répartition des acides aminés semble donc jouer un rôle important sur l’efficacité de livraison du CPP-ELD. Le choix des domaines de pénétration cellulaire et de fuite des endosomes doit donc s’accompagner d’une analyse des peptides générés afin de sélectionner ceux respectant certaines contraintes de structure prédite et de composition en acides aminés (charge, hydrophobicité, amphiphilicité, cœur hydrophobe).

5.6 Conclusion

Dans ce chapitre, nous avons pu étudier les mécanismes impliqués dans la pénétration des peptides CPP- ELDs et la livraison de molécules en co-incubation. Les CPP-ELDs étudiés sont variés par le choix du domaine de pénétration ou de fuite des endosomes qui les composent, ainsi que par la présence possible de séquences riches en histidines et de séquences séparatrices entre les domaines.

Le constat a d’abord été fait sur la dépendance partielle de la livraison selon la nature de la molécule en co- incubation. Les expériences de co-livraison montrent que les CPP-ELDs sont adaptés à livrer des protéines différentes, de par leur taille, leur structure et leur complexité. La taille de la molécule à livrer a été identifiée comme un facteur influençant l’efficacité des CPP-ELDs, avec la livraison de différents dextranes qui diminuait avec l’augmentation de leur taille. Les charges portées par la molécule à livrer sont aussi un facteur important, comme le montre la diminution de livraison de la protéine Cas9 lorsqu’elle est complexée avec ses ARN guides.

Au-delà des capacités de livraison des CPP-ELDs, cette étude s’est intéressée à identifier les voies d’entrée empruntées par ces peptides. Le traitement de cellules en suspension par la protéase trypsine a montré que la protéine GFP-NLS était en partie liée à la membrane plasmique, confirmant cette interaction préalable à son entrée provoquée par les CPP-ELDs. De plus, l’inhibition induite par l’héparine, quel que soit les conditions de livraison, montre une interaction de charges nécessaire entre le CPP-ELD et la membrane plasmique, plus particulièrement les HSPGs. D’un autre côté, la visualisation de l’importation nucléaire de la GFP-NLS par

microscopie a permis de vérifier la disponibilité dans le cytoplasme de la protéine une fois livrée dans le cytoplasme.

Les voies d’entrée des CPP-ELDs ont été investiguées par l’emploi de conditions de culture inhibant certaines voies endocytaires (inhibiteurs, température), et ce pour la livraison de différentes molécules (Cas9 et Cpf1 dans le chapitre 4, GFP-NLS et calcéine dans le chapitre 5). La livraison de GFP-NLS à basse température a confirmé l’implication de mécanismes non-endocytaires, c’est-à-dire que la protéine est au moins en partie livrée directement à travers la membrane plasmique pour rejoindre le cytoplasme. Cette translocation directe évite le passage par les endosomes et est un phénomène rapide. La livraison implique néanmoins des voies endocytaires, comme l’ont montré les résultats avec la Cas9 et la Cpf1, où la basse température a induit une très faible livraison des nucléases. Les inhibitions obtenues également avec la nystatine (pour Cas9 et Cpf1) et la chlorpromazine (pour GFP-NLS) démontrent que les protéines empruntent des voies clathrine- et caveolae-dépendantes.

La déstabilisation des membranes a été étudiée par l’emploi de calcéine. Cette petite molécule fluorescente imperméable aux membranes est naturellement endocytée. Elle peut donc se retrouver dans le cytoplasme cellulaire par translocation directe ou par fuite des endosomes. La répartition ces deux voies a été étudiée en associant l’incubation de calcéine avec le facteur de température. La présence de ces deux mécanismes a été confirmée pour plusieurs CPP-ELDs, avec différents facteurs pouvant influer. Les concentrations et le temps d’incubation peuvent avoir un effet pour favoriser une voie plutôt qu’une autre, mais c’est essentiellement la nature du CPP-ELD qui a déterminé la voie empruntée. 6His-CM18-PTD4 est fortement favorable au mécanisme de translocation directe. A l’opposé, 6His-LAH4-TAT-6His ne provoque la fuite de calcéine que par les endosomes. Enfin, TAT-KALA semble pénétrer par ces deux voies, avec une quantification difficile à évaluer.

La nature des CPP-ELDs semble donc critique dans les capacités de pénétration et de livraison de protéines en co-incubation. Tout d’abord, les charges ont été identifiées comme déterminantes, portées par les arginines, et aussi des lysines. La présence d’alanines, leucines et d’autres acides aminés a laissé supposer la formation d’hélice alpha pour l’acquisition d’une molécule amphiphile. Des seuils de composition en acides aminés peuvent être déterminés afin de respecter les contraintes d’une livraison efficace, et également non toxique. De plus, la présence d’histidines ou de glutamates dans les ELDs étudiés peut permettre de choisir la voie privilégiée d’entrée cellulaire empruntée par le peptide généré. Ces compositions de peptides peuvent aider à la génération d’autres peptides de livraison, à partir de domaines ELDs et CPPs issus de la littérature.

La structure prédite des peptides générés suit les études à propos des ELDs et CPPs. Ces domaines sont le plus souvent favorables à la formation d’une hélice alpha qui lui confère une nature amphiphile. Cette hélice pourra interagir avec la membrane et s’y ancrer, avec une face cationique hydrophile et une face hydrophobe, pour la déstabiliser. La présence d’un cœur hydrophobe dans les ELDs a permis d’évaluer la répartition de l’amphiphilicité qui semble influencer la livraison. Les livraisons efficaces ont été obtenues avec la présence d’un cœur hydrophobe occupant la moitié ou moins de l’hélice. La présence de séquences séparant les domaines affecte la longueur de l’hélice alpha possible, pouvant affecter la pénétration dans les membranes cellulaires. Le peptide de livraison peut donc être considéré comme une séquence ayant une certaine répartition d’acides aminés critiques le long de sa séquence, plutôt que la simple fusion de domaines ELD, CPP et d’histidines.

Les peptides CPP-ELDs générés dans cette étude ont aussi permis de faire la preuve d’applications possibles, comme la livraison d’un facteur de transcription (HoxB4), de nucléases associées à leurs ARN guides (Cas9 et Cpf1), et également de protéines complexes de grande taille (anticorps). Ces applications ouvrent des pistes d’études et de thérapies ex vivo, nécessitant la livraison d’une protéine déficiente dans les cellules-cibles ou d’une protéine correctrice.

5.7 Méthodes

Culture cellulaire

Les cellules HeLa, THP1, CA46 et Jurkat ont été obtenues de ATCC - American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), et mises en culture selon les recommandations du fournisseur. Les myoblastes humains ont été fournis par Pr. J.P. Tremblay (Université Laval, Québec, Canada).

Production et purification de protéines de fusion

La production et la purification des protéines recombinantes GFP-NLS, HoxB4, Cas9-NLS et Cpf1-NLS ont été réalisées selon les méthodes décrites dans les chapitres 3 et 4.

Peptides synthétiques

Les peptides CPPs, ELDs et CPP-ELDs ont été obtenus synthétiquement par le fournisseur GLBiochem (Shanghai, Chine). Le niveau de pureté minimal était de 95%, validé par HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance - high-performance liquid chromatography), et le poids moléculaire souhaité a été confirmée par spectrométrie de masse.

Livraison des protéines mCherry-NLS et GFP-NLS en cellules HeLa

Un jour avant le test de livraison de protéines, les cellules HeLa ont été récoltées par trypsinisation et mises en plaques multipuits (20 000 cellules en plaque 96-puits). Les cellules ont été incubées jusqu’au lendemain dans un milieu de culture avec du sérum (selon la composition recommandée par le fournisseur).

Le jour du test de livraison, le peptide 6His-CM18-PTD4 a été dilué au préalable dans de l’eau purifiée (10 µM en concentration finale), puis le PBS 1X a été ajouté avec par la suite la protéine GFP-NLS et/ou mCherry- NLS (10 µM), le tout dans un volume suffisant pour recouvrir totalement les cellules durant le temps de livraison (50 µL). Des conditions contrôles ont été utilisées, soient les cellules non-traitées, des contrôles en présence de mCherry-NLS et/ou GFP-NLS sans peptide de livraison. Avant la livraison, les cellules ont été lavées au tampon PBS 1X (100 µL en plaque 96-puits et 500 µL en plaque 24-puits) à 37°C. Les solutions contenant les protéines à livrer ont ensuite été déposées sur les cellules, avec un temps d’incubation d’une minute, à température ambiante. A la fin de du temps de livraison, du milieu avec sérum a été ajouté (100 µL), et le volume total a été retiré, et les cellules ont été lavées 3 fois avec du tampon PBS 1X. Enfin, du milieu de culture avec sérum (37°C) a été ajouté et les cellules étaient disponibles pour analyse par microscopie à fluorescence.

Livraison de GFP-NLS en cellules en suspension pour étude de trypsinisation

Un jour avant le test de livraison de protéines, les cellules THP1 et Jurkat ont été récoltées et mises en plaques multipuits (20 000 cellules pour une plaque 96-puits). Les cellules ont été incubées jusqu’au lendemain dans un milieu de culture avec du sérum (selon la composition recommandée par le fournisseur).

Le jour du test de livraison, le peptide 6His-CM18-PTD4 a été dilué au préalable dans de l’eau purifiée (5 µM en concentration finale), puis le milieu sans sérum RPMI a été ajouté avec par la suite la protéine GFP-NLS (10 µM), le tout dans un volume suffisant pour resuspendre facilement les cellules durant le temps de livraison (50 µL). Avant la livraison, le milieu de culture a été retiré après centrifugation (400 g, 2 minutes) et retrait du surnageant, puis les cellules ont été lavées au tampon PBS 1X (100 µL) à 37°C en resuspendant le culot de cellules. Après centrifugation et retrait du surnageant, les solutions contenant les protéines à livrer ont servi à resuspendre le culot cellulaire, puis laissées selon le temps d’incubation d’une minute, à température ambiante. Après, du milieu avec sérum a été ajouté (100 µL) puis les cellules ont été de nouveau centrifugées. Les cellules ont été lavées avec du tampon PBS 1X par la resuspension du culot cellulaire et une nouvelle centrifugation. De la tryspine / EDTA a été ajoutée ou non pour éliminer la GFP potentiellement présente sur les membranes (50 µL diluée 1/10 dans PBS 1X, 2 minutes) et inactivée par ajout de milieu avec sérum (100 µL). Les cellules ont de nouveau été lavées au PBS 1X. Enfin, du milieu de culture avec sérum (37°C) a été ajouté et les cellules étaient disponibles pour analyse.

Livraison de protéine GFP-NLS en cellules adhérentes avec 6His-CM18-PTD4 ou Chariot

Un jour avant le test de livraison de protéines, les cellules HeLa ont été récoltées par trypsinisation et mises en plaques multipuits (20 000 cellules en plaque 96-puits). Les cellules ont été incubées jusqu’au lendemain dans un milieu de culture avec du sérum (selon la composition recommandée par le fournisseur).

Le jour du test de livraison, les peptides 6His-CM18-PTD4 et Chariot ont été dilués au préalable dans de l’eau purifiée (5 ou 50 µM en concentration finale), puis le PBS 1X a été ajouté avec par la suite la protéine GFP- NLS (10 µM), le tout dans un volume suffisant pour recouvrir totalement les cellules durant le temps de livraison (50 µL). Des conditions contrôles ont été utilisées, soient les cellules non-traitées, un contrôle en présence de GFP-NLS sans peptide de livraison. Avant la livraison, les cellules ont été lavées au tampon PBS 1X (100 µL en plaque 96-puits et 500 µL en plaque 24-puits) à 37°C. Les solutions contenant les protéines à livrer ont ensuite été déposées sur les cellules, avec un temps d’incubation de 15 secondes, à température ambiante. A la fin de du temps de livraison, du milieu avec sérum a été ajouté (100 µL), et le volume total a été retiré, et les cellules ont été lavées 3 fois avec du tampon PBS 1X. Enfin, du milieu de culture avec sérum (37°C) a été ajouté et les cellules étaient disponibles pour analyse par microscopie à fluorescence.

Etude d’importation nucléaire de GFP-NLS

Un jour avant le test de livraison de protéines, les cellules HeLa ont été récoltées par trypsinisation et mises en plaques multipuits (20 000 cellules en plaque 96-puits). Les cellules ont été incubées jusqu’au lendemain dans un milieu de culture avec du sérum (selon la composition recommandée par le fournisseur).

Le jour du test de livraison, les peptides 6His-CM18-PTD4 et Chariot ont été dilués au préalable dans de l’eau purifiée (50 µM en concentration finale), puis le PBS 1X a été ajouté avec par la suite la protéine GFP-NLS (10 µM), le tout dans un volume suffisant pour recouvrir totalement les cellules durant le temps de livraison (50 µL). Avant la livraison, les cellules ont été lavées au tampon PBS 1X (100 µL en plaque 96-puits et 500 µL en plaque 24-puits) à 37°C. Les solutions contenant les protéines à livrer ont ensuite été déposées sur les cellules, avec un temps d’incubation de 15 secondes, à température ambiante. A la fin de du temps de livraison, du milieu avec sérum a été ajouté (100 µL), et le volume total a été retiré, et les cellules ont été lavées 1 fois avec du tampon PBS 1X. Enfin, du milieu de culture avec sérum (37°C) a été ajouté. Les cellules ont été mises immédiatement au microscope pour une acquisition d’images de 45 secondes à 2 minutes après la livraison.

Test d’inhibitions des voies de livraison

Les tests d’inhibition des voies de livraison ont été réalisés en cellules HeLa. Les cellules ont été mis en présence de chlorpromazine, nystatine, amiloride et héparine pendant une heure, dans du milieu sans sérum, selon les concentrations fournies dans le tableau ci-dessous.

Réactif Fournisseur Numéro de catalogue Concentration finale

Chlorpromazine Sigma-Aldrich C8138 30 nM

Nystatine Sigma-Aldrich N6261-5MU 50 µg/ml

Amiloride Sigma-Aldrich A-7410 1 mM

Héparine Sigma-Aldrich H3393-10KU 25 µg/ml

Les cellules HeLa ont été préparées comme pour des livraisons de GFP-NLS ou de calcéine. Après l’heure d’incubation dans du milieu sans sérum en présence d’inhibiteurs ou non, les cellules ont été lavées au tampon PBS1X (100 µL) et les livraisons ont été réalisées également en présence ou non d’inhibiteurs, aux mêmes concentrations.

L’inhibition de l’endocytose par la température a été réalisée selon la même approche que les inhibiteurs précédents, avec un temps d’incubation d’une heure à +4°C préalable à la livraison, elle-même réalisée également à +4°C.

Test de fuite de calcéine et de dextranes-FITC

Les tests de microscopie et de cytométrie pour la calcéine et les dextranes ont été développés pour évaluer la perméabilité des membranes plasmique et endosomales en présence d’un peptide CPP-ELD. Un jour avant le test de perméabilisation, les cellules HeLa ont été récoltées par trypsinisation et mises en plaques multipuits (20 000 cellules en plaque 96-puits). Les cellules ont été incubées jusqu’au lendemain dans un milieu de culture avec du sérum (selon la composition recommandée par le fournisseur).

Le jour du test, le milieu est retiré et les cellules sont lavées avec du PBS1X (100 µL). Du milieu DMEM sans sérum avec 62.5 µg/mL (100 µM) de calcéine, ou 2.5 mg/ml de FITC-dextran (Sigma FD10S-100MG - 10 kDa / Sigma 46945-100MG-F - 70 kDa / Sigma FD250S-100MG - 250 kDa) est déposé sur les cellules (50 µL) pour 30 minutes, en présence ou non de peptides CPP-ELDs. Après incubation le milieu est retiré et les cellules sont lavées 3 fois au PBS1X (100 µL), puis du milieu DMEM avec 10% de FBS est ajouté (100 µL). Les cellules sont alors analysées par microscopie à fluorescence (Olympus IX70) et par cytométrie de flux (BD