CPPs fusionnés avec la protéine GFP

La livraison de protéines vers le cytoplasme ou le noyau cellulaire par l’emploi de solutions protéiques est essentiellement retrouvée par les CPPs. Ces courtes séquences protéiques sont placées en fusion à

l’extrémité de la protéine à livrer. Dans cet objectif, deux CPPs ont été choisis pour la livraison de la protéine GFP. La fluorescence de cette dernière permet de réaliser une analyse qualitative de la livraison par microscopie, afin d’identifier les compartiments intracellulaires atteints, ainsi qu’une analyse quantitative par cytométrie de flux, afin de connaître la proportion de cellules contenant la protéine.

Les deux CPPs choisis sont les premiers identifiés dans la littérature, TAT et pénétratine, encore utilisés dans des études récentes299,426_{. TAT et pénétratine ont été associés à la GFP par clonage afin que le CPP soit à}

l’extrémité N-terminale de la GFP. Les protéines générées sont TAT-GFP et Pénétratine-GFP (Pen-GFP), qui contiennent également une étiquette de six histidines (6His) pour la purification de la protéine produite de manière recombinante en E. coli. Les domaines de ces protéines recombinantes (6His, CPP, GFP) sont séparés par des séquences séparatrices, constituées de résidus flexibles glycines et sérines pour ne pas interférer avec les domaines. Les séquences des différentes protéines recombinantes GFP dans cette étude sont données dans le Tableau 4 :

Tableau 4 - Protéines recombinantes de fusion GFP, GFP-NS et CPP-GFP

Protéine Séquence primaire

GFP MHHHHHHGGGGSGGGGSGGASTGTGIRMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICT TGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKG IDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSAL SKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGGSGGGSGWIRASSGGREIS GFP-NLS MHHHHHHGGGGSGGGGSGGASTGTGIRMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICT TGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKG IDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSAL

SKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGGSGGGSGWIRASSGGRSSDDEATADSSDDEATADSQHAAP

PKKKRKVGGSGGGSGGGSGGGRGTEIS

Pen-GFP MHHHHHHGGGGSGGGGSGGASTGTRQIKIWFQNRRMKWKKPPQGGGGSGGGGSGGGTGIRMVSKGEELFTGVV PILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPE GYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNI

EDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGGSGGG

SGWIRASSGGREIS

TAT-GFP MHHHHHHGGGGSGGGGSGGASTGTGRKKRRQRRRPPQGGGGSGGGGSGGGTGIRMVSKGEELFTGVVPILVELD GDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQER TIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQ

LADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGGSGGGSGWIRA

SSGGREIS

Après la production des protéines en bactéries E. coli BL21DE3 et leur purification, TAT-GFP et Pen-GFP ont été utilisées pour leurs livraisons dans des cellules HeLa. Ce choix de cellules a été effectué en raison de leur forte adhérence afin de réaliser suffisamment de lavages pour éliminer la fluorescence résiduelle (bruit de fond). Les livraisons réalisées avec GFP, GFP-NLS, Pen-GFP et TAT-GFP sur des cellules HeLa durant 1 heure ont abouti aux résultats présentés dans le Tableau 5 et la Figure 20.

Tableau 5 - Résultats de cytométrie de flux de livraison de GFP fusionnée à des CPPs

Condition Score de viabilité Moyenne (unités relatives _{de fluorescence)} Pourcentage Test 1 HeLa non-traitées 100,0% 4 212 0,0% GFP 10 µM 100,0% 5 315 0,9% GFP-NLS 10 µM 87,7% 9 123 7,2% Test 2 HeLa non-traitées 100,0% 2 429 0,3% Pen-GFP 1 µM 100,0% 3 758 8,6% Pen-GFP 5 µM 100,0% 6 358 35,2% Pen-GFP 10 µM 93,5% 11 672 67,3% Test 3 HeLa non-traitées 56,5% 3 030 0,2% GFP 10 µM 89,8% 3 316 0,7% GFP-NLS 10 µM 94,9% 2 863 0,1% TAT-GFP 10 µM 46,8% 6 271 12,6%

Les constructions GFP, GFP-NLS et CPP-GFP ont été déposées sur des cellules HeLa pendant 1 heure, en milieu sans sérum. Après livraison et un lavage au tampon PBS, les cellules on été trypsinisées et analysées par cytométrie de flux. Les constructions GFP sans CPP fusionné présente un faible pourcentage de cellules détectées comme positives à la protéine. Des pourcentages signficatifs ont été obtenus avec TAT-GFP et Pen-GFP.

Le premier test a permis de faire la preuve que la GFP seule, ou associée par fusion à un NLS, ne peut franchir les barrières cellulaires. Une légère fluorescence a été constatée au cytomètre par rapport au contrôle non-traité, qui a également été observée en microscopie (Figure 20).

Analyse par microscopie à fluorescence des livraisons de GFP, GFP-NLS, TAT-GFP et Pen-GFP (mêmes conditions que Figure 19).Les constructions sans CPP présentent des signaux de fluorescence faibles et non-diffus dans les cellules HeLa. Pen-GFP présente un signal en agrégats, infirmant une liraison détectée en cytométrie de flux. TAT-GFP présente un signal ponctué, synonyme d’endocytose et de séquestration endosomale.

La Pen-GFP a fourni des résultats de livraison positifs au cytomètre de flux, mais l’observation au microscope a infirmé ces rendements de livraison, puisque la Pen-GFP présentait un signal d’agrégats à l’extérieur des cellules et possiblement un signal intracellulaire ponctué, synonyme de localisation endosomale. TAT-GFP n’a permis qu’un faible rendement de livraison au cytomètre de flux. Cependant, presque toutes les cellules au microscope présentaient un signal fluorescent, avec peu ou pas d’agrégat. A plus fort grossissement (20X), ce signal s’est avéré entièrement ponctué au niveau des cellules. Il est donc supposé que TAT-GFP est bien endocytée par les cellules, mais est incapable de rejoindre le cytoplasme.

Afin de vérifier l’endocytose de CPP-GFP, des livraisons de GFP, TAT-GFP et Pen-GFP ont été réalisées en cellules HeLa, avec un marqueur des endosomes et lysosomes (LysoTracker, en rouge), et des noyaux du Hoechst (en bleu). Les cellules ont alors été observées en microscopie confocale (Figure 21).

Figure 21 - Microscopie confocale de livraison de CPP-GFP en cellules HeLa

GFP, TAT-GFP et Pen-GFP (10µM) ont été incubées sur des cellules HeLa pendant 1 heure, en milieu sans sérum. Après livraison et plusieurs lavages PBS, les cellules ont été analysées par microscopie confocale à fluorescence.

Comme précédemment, le signal fluorescent des protéines TAT-GFP et Pen-GFP est ponctuel (Figure 21A). De plus, ce signal est situé en périphérie du noyau, excluant une livraison nucléaire. La GFP seule n’a pas été observée sur ou dans les cellules. Les endosomes et les lysosomes sont des vésicules acides impliquées dans le processus d’endocytose, et leur marquage aboutit à un signal également ponctuel. La co-localisation

de la Pen-GFP et du LysoTracker (Figure 21B) confirme donc l’emprisonnement des protéines CPP-GFP dans ces vésicules, et que le signal n’est pas uniquement situé sur la membrane plasmique. La fonction de pénétration par TAT semble donc possible pour la livraison d’une protéine en fusion, mais la livraison jusqu’au cytoplasme demeure incomplète, en raison d’une fuite des endosomes inefficace.