2 Synthèse de la littérature
2.5 Méthodes analytiques de suivi de la pénétration cellulaire et de la fuite des endosomes
2.5.1
Méthodes d’identification des voies de livraison
La détermination des voies de livraison impliquées pour une protéine donnée présente des difficultés, car la simple visualisation par marquage fluorescent reste insuffisante. En effet, une protéine placée sous certaines conditions qui emprunte la voie de translocation directe sera visualisée comme diffuse dans le cytoplasme ou le noyau cellulaire, alors que la voie endocytaire se présentera par un signal ponctuel correspondant aux vésicules d’endocytose399,400 (signal pouvant aussi signifier des agrégats). Cependant, les nombreuses
recherches qui se contredisent sur les voies empruntées ont mis l’accent sur l’influence de nombreux paramètres43. La concentration de la protéine de livraison249, sa charge, sa taille, la température401, le type
cellulaire, le temps d’incubation et encore la présence de cargo et sa liaison250, sont tous des facteurs
influençant les voies empruntées96.
Même si un consensus se dessine sur la présence de plusieurs voies de livraison à la fois, il est intéressant d’utiliser des techniques variées pour déterminer la prédominance d’une voie par rapport à une autre, afin de connaître les cinétiques en jeu et de pouvoir optimiser les technologies développées270,261,402. La majorité des
recherches effectuées sur les voies d’entrée cellulaire a employé des inhibiteurs des différentes voies endocytaires403. De nombreuses drogues sont capables d’inhiber spécifiquement la macropinocytose, les
voies dépendant de la clathrine ou de la cavéoline ou les voies indépendantes (amiloride, chlorpromazine, cytochalasine D, genistéine, nystatine…)66,94,134,157,172,266,271,319,357,404–406. Des travaux ont aussi utilisé un
siRNA pour inactiver le contrôle de certaines voies endocytaires105,407. Cependant, l’inhibition d’une voie peut
favoriser l’entrée de la protéine par une autre. Ainsi, un changement d’efficacité de livraison indiquera seulement l’implication d’une ou plusieurs voies, sans quantifier précisément en quelle proportion. L’endocytose dans son ensemble peut être stoppée par une température de 4°C, permettant d’indiquer la présence de translocation directe (comme le montre la Figure 19). La différence de livraison entre 4°C et 37°C indiquera quant à elle la proportion entre ces deux voies134,157,268,271,304.
La translocation directe par une protéine de livraison permet une livraison rapide dans le cytoplasme, mais peut nuire à l’intégrité de la membrane plasmique. Les voies endocytaires sont plus lentes, et amènent la protéine et son cargo à une nouvelle barrière critique, puisque ces derniers doivent alors franchir la membrane endosomale avant de rejoindre le cytoplasme.
Figure 19 – Modèle d’entrée de CPPs dans les cellules de mammifères selon la température (Jones, 2007)
2.5.2 Détection de la fuite des endosomes et étude de ses mécanismes
La fuite des endosomes étant l’élément limitatif de la livraison de molécules thérapeutiques par endocytose, des outils ont été développés pour l’étudier42. L’obtention d’un résultat de livraison reflète généralement le
rendement global du parcours depuis le milieu extracellulaire et la fonctionnalité du cargo. Étudier cette seule étape permet de développer des molécules spécialisées pour la fuite des endosomes284. La figure fournie en
Annexe 5 présente les phénomènes de fuite des endosomes possibles et présente des techniques de détection.
Une meilleure compréhension des mécanismes en jeu permet de générer des protéines de fuite des endosomes plus performantes. Les caractéristiques d’un ELD dans un peptide de livraison peuvent être étudiées selon l’influence que pourront avoir le pH ou la concentration pour déstabiliser les membranes. Des tests de modélisation ou de dégradation de vésicules selon le pH existent pour évaluer la capacité de fuite des endosomes d’un peptide, et pour déterminer comment ce peptide interagit avec la membrane endosomale305,408,409.
Les tests les plus courants impliquent l’utilisation de sondes fluorescentes pour visualiser de manière qualitative mais aussi quantitative les cellules présentant de la fuite des endosomes. Les sondes retrouvées de manière récurrente sont données dans l’Annexe 6. Des études ont utilisé des liposomes contenant un fluorochrome, qui lors d’une déstabilisation membranaire ou d’une formation de pores est relâché dans le milieu410. Ces molécules émettent souvent moins de fluorescence dans le liposome, en raison de leur haute
concentration ou du pH simulant la lumière endosomale. Un relargage de ces molécules fluorescentes des liposomes est quantifiable par spectrométrie. Il est donc possible d’évaluer de manière relative l’efficacité d’une molécule possédant des propriétés de fuite des endosomes, comme les polymères cationiques ou des peptides. Cependant, ces systèmes restent éloignés du système cellulaire, et la corrélation des résultats n’est pas certaine411. Pour l’étude en cellules, il est nécessaire que la sonde fluorescente soit naturellement
endocytée pour se retrouver dans la lumière endosomale. La fuite des endosomes de la sonde via la molécule étudiée est alors visualisée de manière qualitative en microscopie (signal ponctué endosomal ou diffus cytoplasmique) ou quantitative en cytométrie de flux (proportion de cellules présentant une fluorescence augmentée). Deux sondes fluorescentes sont souvent retrouvées : la calcéine, et le dextrane couplé à un fluorochrome. Ce premier présente l’intérêt d’être utilisable aussi bien en microscopie qu’en cytométrie de flux106,218,237,354,412–416. Le second est un polymère ramifié de dextrose, dont la taille peut être très variable (de
quelques kDa à plus de 100 kDa)118,172,417. On peut aussi citer la naphthofluorescéine, dont la fluorescence
est aussi dépendante du pH418. Le marquage des vésicules cellulaires acides, incluant les endosomes, peut
également être fait par certains produits, comme le LysoTracker, ou des protéines constitutives des endosomes comme Rab5 et Rab7 fusionnées une protéine fluorescente357.
La sonde fluorescente peut être intégralement protéique. GFP a déjà été couplée à un CPP TAT pour évaluer sa localisation cellulaire avec sa fuite des endosomes provoquée par CM18-TAT218. Un système de livraison
s’étant complexées avec le reste de GFP déjà présent dans la cellule166. Il est aussi possible de suivre la
localisation cellulaire du cargo thérapeutique que l’on souhaite livrer. La livraison d’ADN peut être suivie en réalisant un fractionnement cellulaire des différents compartiments étudiés, suivi d’une PCR quantitative (quantitative polymerase chain reaction, amplification en chaîne par polymérase quantitative)419,420.
L’étape de fuite des endosomes peut être influencée par la chloroquine, qui dégrade les membranes endosomales et peut ainsi relarguer le complexe protéique endocyté134,421. La chloroquine a néanmoins une
influence sur l’endocytose, puisqu’elle empêche la fusion entre les vésicules endocytaires nécessaire à leur maturation357. Ainsi, une augmentation de la livraison en présence de chloroquine met en avant que la fuite
des endosomes n’est pas totalement assurée, alors qu’une diminution indique simplement une livraison dépendante de l’endocytose. La bafilomycine A1 inhibe l’acidification des endosomes, et le chlorure d’ammonium augmente le pH des endosomes tardifs, soulignant ainsi la dépendance de l’action d’un système de fuite des endosomes66,266,406,422. Concernant la livraison de protéines d’intérêt, une immunofluorescence
peut être réalisée sur des cellules fixées, en co-localisation avec un marqueur endosomal. Un marquage de la protéine d’intérêt peut amener à de l’imagerie de cellules vivantes423. Des analyses par microscopie plus
poussées existent également, comme la microscopie confocale pour localiser au mieux les vésicules endocytaires419, voire la microscopie électronique265,424. Un tableau en Annexe 7 récapitule les techniques
envisageables pour suivre la livraison dans les cellules de mammifères.
Il n’existe donc pas de système de détection idéal, conjuguant facilité de mise en place et de détection, possibilité de quantification, et application directe à une protéine thérapeutique. C’est donc l’association de plusieurs techniques qui permet de détecter au mieux l’étape de fuite des endosomes, afin d’étudier et de concevoir un agent efficace.