Propriétés structurales des peptides nécessaires à la livraison de protéines

Les CPP-ELDs incluent au minimum deux domaines fonctionnels, auxquels peuvent s’y ajouter d’autres domaines potentiels (site de liaison spécifique par exemple), des séquences étiquettes (séquences d’histidine par exemple), ou encore des séquences séparatrices. Les caractéristiques physiques des CPPs et des ELDs ont été identifiées dans la littérature au cours des dernières années, et il est important de les appliquer dans la conception de CPP-ELD43,335,336_.

Les CPP-ELDs conçus jusqu’à aujourd’hui n’ont pas été caractérisés comme un ensemble. Les domaines ont été pris séparément depuis différentes études passées pour être associées. Ces peptides spécialisés prennent souvent une forme hélicale dans un contexte membranaire, suivant la concentration ou le pH. Ces hélices ont été étudiées pour leur charge, hydrophobicité et taille, et la répartition des acides aminés sur l’hélice également. La répartition des acides aminés sur une hélice peut créer des régions particulières, comme une région cationique par exemple. Dans l’étude de Salomone et al., le peptide de fuite des endosomes CM18 a été fusionné avec TAT, sans séquence séparatrice218_{. La structure secondaire et le}

mécanisme associé peuvent se trouver affectés par cette association, comme la longueur de l’hélice alpha, que plusieurs chercheurs définissent comme critique pour l’efficacité de déstabilisation membranaire337,338_{. Le}

placement d’acides aminés sur une face particulière du peptide de livraison doit tenir compte de la structure obtenue dans la membrane cellulaire. Ainsi, Daniels et Schepartz ont placé des arginines à intervalles réguliers pour améliorer la perméabilité membranaire339_{. Ces caractéristiques critiques, comme}

l’hydrophobicité, le moment hydrophobe et les charges, ont été traitées dès 1984 par D. Eisenberg pour des peptides comme la mélittine et la cécropine, et ces outils ont depuis été repris340,341_{. Le design de nouveaux}

peptides peut inclure des variations de ces paramètres pour mieux comprendre les facteurs les plus influents, et pour optimiser le peptide de livraison pour chaque type d’application visé. Des caractéristiques structurales ont déjà été déterminées comme nécessaires pour provoquer une entrée cellulaire. A. Scheller et al. font le bilan que le peptide doit être amphiphile, doit contenir des alanines pour favoriser une hélice alpha de 4 tours d’hélice au minimum, et avec une charge positive minimale342_{. Les séquences peuvent être présentées en}

projection d’hélice alpha, ou par une vue latérale de l’hélice (Figure 18), afin de vérifier la répartition des acides aminés le long de la structure pour respecter l’amphiphilicité205,342_{. Un calcul du moment hydrophobe}

de la portion d’intérêt peut aussi être fait.

Figure 18 - Vue latérale d'hélice alpha des peptides GALA et KALA (Wyman et al. 1997) et projection d'hélice alpha du peptide KLA1 (Scheller et al. 1999)

Le design préalable à des tests de livraison passe donc par les points suivants. Tout d’abord le peptide doit respecter certaines limites de charges et d’hydrophobicité afin d’être soluble dans un tampon approprié à la culture cellulaire. Par exemple, E5-TAT, produit synthétiquement, est dilué au préalable dans du DMSO, ce qui pourrait affecter la viabilité cellulaire suivant sa concentration305_{. Un minimum de charges positives est}

nécessaire pour que le segment CPP interagisse avec la membrane plasmique (le plus souvent une charge de +5 est retrouvée)43_{. La conception du domaine ELD dépend du mécanisme recherché. Dans le cas de CM18,}

une alternance de différents types d’acides aminés permet une répartition en hélice alpha d’une région hydrophobe (composée de tryptophane, leucines, phénylalanine, isoleucine et valines) et d’une région chargée positivement (composée de lysines)218_{. CM18 peut alors déstabiliser les membranes endosomales}

lorsqu’un certain seuil de concentration est atteint. Pour HA2 et ses dérivés, l’incorporation d’histidines, d’aspartates et de glutamates sur l’hélice alpha permet la dépendance de l’agent de livraison au pH182_.

L’aspartate et le glutamate étant chargés négativement à pH physiologique, il est possible que des interactions non-souhaitées aient lieu avec les charges positives du reste du peptide, pouvant donc inhiber ses fonctions. Une région riche en histidines peut aussi être incorporée, afin d’induire le phénomène d’éponge à protons et faciliter la fuite des endosomes242,343–347_{. La longueur de l’ensemble ou d’une partie du peptide joue}

également un rôle sur l’efficacité de déstabilisation membranaire348_{. La longueur de la région amphiphile peut}

potentiellement être modulée. A. Ulrich a déterminé qu’une longueur d’hélice alpha plus faible que l’épaisseur de la membrane aboutit à une absence de déstabilisation, alors qu’une longueur identique peut former des pores, et qu’une longueur supérieure peut induire une forte déstabilisation membranaire349_{. L’incorporation de}

cystéines sur le peptide et le cargo peut aussi favoriser leur interaction, ou la création de dimères de peptides qui peut éventuellement favoriser leur effet comme dfTAT325,326_.

Les CPP-ELDs étant de petite taille et très amphiphiles, il est difficile de les produire par une stratégie de protéine recombinante. De plus, ce mode d’obtention oblige la présence d’une méthionine à l’extrémité N- terminale de la protéine, et la présence d’un ou plusieurs tags de purification. Aussi, la production recombinante en bactéries induit la présence d’endotoxines qui peuvent interférer avec les activités biologiques recherchées175,350,351_{. La production de manière synthétique est donc plus appropriée pour}

l’obtention d’un nombre conséquent de peptides. La plupart des CPPs sont pour la plupart obtenus de cette manière dans la littérature, même si plusieurs stratégies de production de productions existent331_{. Les}

peptides synthétisés doivent être facilement solubilisés, afin d’éviter l’emploi de produits potentiellement toxiques (DMSO, acide acétique, TFA…)58,172,352_.