Livraison d’anticorps

Comme vu dans ce chapitre, les CPP-ELDs sont capables de livrer des molécules de grande taille (dextranes, Cas9, Cpf1). Les tests menés employant différentes tailles de dextranes ont tout de même montré une diminution de l’efficacité de livraison avec l’augmentation de la taille de la molécule à livrer. Les protéines GFP-NLS (35.0 kDa), mCherry-NLS (34.7 kDa) et HoxB4 (28.5 kDa) ont été livrées dans divers types cellulaires par différents peptides CPP-ELDs. Malgré ce constat, les CPP-ELDs ont pu livrer les protéines Cas9-NLS (169.9 kDa) et Cpf1-NLS (155.7 kDa) de haut poids moléculaire.

Dans cette partie, nous nous sommes intéressés à livrer un autre type de protéine de haut poids moléculaire, les anticorps. Ces molécules constituées de quatre chaînes polypeptidiques ont un poids moléculaire total d’environ 150 kDa. La différence de structure par rapport aux nucléases Cas9 et Cpf1 présente un intérêt d’étude. En effet, le défi de la livraison d’anticorps réside dans la nécessité de livrer la protéine dans sa structure fonctionnelle, afin que ses propriétés de reconnaissance d’antigène perdurent une fois dans la cellule294,474,475_{. De plus, la livraison d’anticorps natifs dans les cellules de mammifères présente des intérêts}

d’études et thérapeutiques476,477_{, comme décrit dans le chapitre 2.}

premières livraisons (0.5 µM d’anticorps) ont été effectuées avec les peptides CM18-TAT et CM18- Pénétratine (3.5 µM), pendant une heure dans du milieu sans sérum, sur des cellules HeLa. Les résultats de livraison obtenus par cytométrie de flux sont présentés dans la Figure 65.

Figure 65 - Livraison d'anticorps anti-tubuline par CPP-ELD

Livraison d’un anticorps anti-tubuline-FITC (0,5 µM) par CM18-TAT ou CM18-Pen (3,5 µM) dans des cellules HeLa pendant une heure, dans du milieu sans sérum. Détection par cytométrie de flux, 2 heures après la livraison.

Comme attendu, l’anticorps seul est incapable de franchir les barrières cellulaires et n’est donc pas détecté lors de la cytométrie de flux. En présence de CPP-ELD, l’anticorps est retrouvé dans un grand nombre de cellules. CM18-TAT permet la détection de l’anticorps dans plus de 35% des cellules, et CM18-Pénétratine dans près de 50% des cellules (malgré une toxicité apparente plus élevée pour ce dernier). Cependant, le signal obtenu étant très faible, la microscopie n’a pas permis de conclure quant à la localisation intracellulaire.

Ainsi, le peptide 6His-CM18-PTD4-6His a été employé pour livrer deux anticorps distincts, soient un anticorps anti-tubuline couplé à un fluorochrome Alexa Fluor® 488, et un anticorps contrôle contre IgG couplé à un Alexa Fluor® 488. Ce dernier, utilisé normalement en tant qu’anticorps secondaire dans un protocole d’immunofluorescence, n’a pas de cible dans la cellule HeLa. Il est donc utilisé pour comparer la spécificité des deux anticorps employés une fois livrés jusqu’au cytoplasme. La livraison a été effectuée avec 2 µM d’anticorps, 8 µM de 6His-CM18-PTD4-6His, sur des cellules HeLa pendant une minute. La détection des anticorps livrés a été effectuée par microscopie à fluorescence, dont les résultats sont présentés dans la Figure 66. S c o r e d e v ia b il it é ( % ) P o u r c e n ta g e d e l iv r a is o n ( % ) Co ntr ôle An ti-t ub uli ne 0.5 µM + C M1 8-T AT 3.5 µM + C M1 8-P én étr ati ne 3.5 µM 0 5 0 1 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 S c o r e d e v ia b ilité ( % ) P o u r c e n ta g e d e liv r a is o n ( % )

Figure 66 - Livraison d'anticorps par CPP-ELD

Livraison de différents anticorps marqués AF488 (2 µM) par 6His-CM18-PTD4-6His (8 µM) dans des cellules HeLa pendant une minute, dans du tampon PBS. Détection par microscopie à fluorescence, 2 heures après la livraison.

Les deux anticorps ont pu être détectés dans les cellules HeLa, cependant le profil du signal était identique, avec un signal diffus dans l’ensemble de la cellule. Le réseau de microtubules de la cellule qui est composé de la protéine ciblée n’a pas été observé. On peut émettre plusieurs hypothèses à l’obtention de ce résultat. Tout d’abord l’anticorps n’est peut-être pas fonctionnel une fois dans la cellule, avec pour cause possible la dégradation de la protéine dans le cytoplasme ou lors de la livraison. Enfin, il est possible qu’une part des anticorps ne se lient pas à la cible et restent diffus dans le cytoplasme. Il est à noter que la quantité d’anticorps employée est très élevée, et présente donc une contrainte pour la détection dans la cellule. Il serait donc intéressant de réaliser des livraisons d’anticorps à plus faible concentration vers une cible plus localisée dans la cellule que la tubuline, comme un marquage périnucléaire par exemple.

Il est possible de contrôler la quantité d’anticorps livré avec la concentration de CPP-ELD utilisé. Comme le montre la Figure 67, une concentration élevée de 6His-CM18-PTD4 était nécessaire pour obtenir une livraison significative d’un anticorps anti-actine couplé à un fluorochrome FITC (5µM). Ainsi, la concentration de CPP- ELD (35 µM), le temps de livraison (1 minute) et la taille de la protéine à livrer (150 kDa) sont des paramètres qui laissent supposer une livraison privilégiée par translocation directe, en concordance avec l’études des dextranes de différentes tailles. Une étude plus poussée des mécanismes de livraison (livraison à basse température, emploi de drogues, différents temps d’incubation) permettrait de valider ou infirmer cette hypothèse. Cette étude n’a pas été réalisée en raison d’une faible quantité d’anticorps disponible.

Figure 67 - Livraison d'anticorps anti-actine à dose croissante de 6His-CM18-PTD4

Dose-réponse de 6His-CM18-PTD4 (5/10/35 µM) pour la livraison d’un anticorps anti-actine-FITC (5 µM) dans des cellules HeLa pendant une minute, dans du tampon PBS. Détection par cytométrie de flux, 2 heures après la livraison.

La livraison d’anticorps constitue donc un défi en raison de leur taille et leur complexité. Des études ont recherché des alternatives telles que la livraison d’un fragment scFv fusionné à un domaine d’internalisation478–480_{. Une protéine de cette taille (environ 30 kDa) se rapproche donc des livraisons}

effectuées dans cette étude (GFP et ses dérivés, mCherry, HoxB4) et serait donc un candidat potentiel pour la poursuite de l’étude des CPP-ELDs. De plus, la détection du lien entre l’anticorps et sa cible par une méthode plus fine serait plus appropriée. On pourrait par exemple rechercher l’inhibition d’une voie métabolique par un anticorps.