5.1. L’optogénétique
« L’optogénétique est la combinaison de méthodes génétiques et optiques permettant d’obtenir un gain ou une perte de fonction d’événements définis dans des cellules spécifiques de tissus vivants » (Deisseroth, 2011). Ainsi, contrairement aux stimulations magnétiques ou électriques trop imprécises et à la pharmacologie moins spécifique, agissant trop lentement et limitée par le passage de la barrière hémato-encéphalique, l’optogénétique est une combinaison d’outils permettant de contrôler de façon ciblée, rapide et transitoire un type de cellule dans le cerveau tout en laissant les autres inchangées.
Certains micro-organismes produisent des protéines activées par la lumière visible capables de réguler directement le flux d'ions à travers la membrane plasmique. La bactériorhodopsine fut découverte en 1971. Il s’agit d’une pompe ionique pouvant être rapidement activée par lumière visible (Oesterhelt & Stoeckenius, 1971). Par la suite, l’halorhodopsine et la channelrhodopsine furent découvertes respectivement en 1977 (Matsuno-Yagi & Mukohata, 1977) et en 2002 (Nagel et al., 2002). Enfin, l’équipe de Karl Deisseroth démontra en 2005 que l’introduction d’une opsine dans un neurone rendait celui-ci sensible à la lumière (Boyden et al., 2005). Il est ainsi possible d’activer ou d’inhiber un neurone spécifique de façon rapide et transitoire en réponse à une lumière d’une certaine longueur d’onde.
En particulier, la channelrhodopsine, issue de l’algue verte, est composée d’une protéine à 7 hélices transmembranaires, l’opsine, ainsi que d’un rétinal sensible à la lumière. Il existe deux types de channelrhodopsines : la channelrhodopsine-1 (ChR1) et la channelrhodopsine-2 (ChR2). Toutes deux activées par la lumière bleu (λ = 430-520 nm, max = 470 nm), la ChR2 entraîne un influx de cations alors que la ChR1 n’est spécifique que des protons (Nagel et al., 2003).
La ChR2 est ainsi préférentiellement utilisée pour induire l’activation spécifique d’un neurone. D’autres types de protéines photosensibles existent également et certaines, comme l’archaerhodopsine (activée par la lumière verte) ou l’halorhodopsine (activée par la lumière jaune) entraînent une inhibition neuronale, respectivement via une sortie de protons ou une entrée d’ions chlorure, lorsqu’elles sont stimulées.
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5.2. L’optogénétique appliquée aux cellules de Purkinje et la lignée de souris L7-ChR2
L’application de la transgénèse aux cellules de Purkinje a débuté en 1988 avec la découverte du gène L7 (ou pcp2, Purkinje cell protein-2), situé sur le chromosome 8 de la souris. Le gène L7 est l'un des rares gènes hautement spécifique d’un type cellulaire. En effet, il est exclusivement exprimé dans les cellules de Purkinje cérébelleuses et les neurones bipolaires de la rétine (Barski et al., 2000).
Une lignée de souris transgéniques de souche CD1 a récemment été développée grâce à la stratégie de modification BAC (bacterial artificial chromosome) (Chaumont et al., 2013). Cette lignée permet de pallier aux difficultés inhérentes aux autres méthodes d’expression en évitant l’injection locale de virus recombinants via le système Cre/Lox (Madisen et al., 2012; Nguyen-Vu et al., 2013). Ainsi, les souris L7-ChR2 expriment spécifiquement dans les cellules de Purkinje une version mutée de la ChR2 (H134R, présentant une meilleure sensibilité à la lumière (Lin, 2012)) associée à une YFP (yellow fluorescent protein) permettant de visualiser les cellules ChR2 positives par imagerie à fluorescence (λexcitation = 514nm ; λémission = 527nm) (voir figure 12). Les gènes codant pour la ChR2(H134R)-YFP sont ainsi placés sous le contrôle du gène promoteur L7/pcp2.
Les souris L7-ChR2(H134R)-YFP ainsi créées sont capables de se reproduire et de transmettre leurs caractéristiques à leur descendance. L’hétérozygotie étant nécessaire et suffisante pour exprimer la ChR2-YFP dans les cellules de Purkinje, un animal sur deux est statistiquement ChR2 positif dans une portée. Notons également que les souris L7-ChR2 présentent les mêmes performances comportementales que les souris sauvages CD1, le transgène ne perturbe donc pas les fonctions motrices (Chaumont et al., 2013).
D’autre part, les protéines ChR2 sont exprimées tout le long des dendrites des cellules de Purkinje et leur densité est évaluée à entre 150 et 300 canaux/µm2. Les cellules de Purkinje semblent également systématiquement activées par une illumination bleue d’irradiance comprise entre 3 et 20 mW/mm2. En outre, pour une irradiance supérieure à 3 mW/mm2, 20ms d’illumination des cellules de Purkinje permettent d’inhiber efficacement les noyaux profonds cibles (Chaumont et al., 2013). Enfin, la stimulation optogénétique des cellules de Purkinje chez la souris L7-ChR2 induit une inhibition suivie d’une activation rebond se propageant le long du circuit cérébello-thalamo-cortical (Proville et al., 2014) (voir figure 13).
Ainsi, la souris CD1 L7-ChR2 peut développer un phénotype parkinsonien par injection locale de 6-OHDA ainsi que des dyskinésies par administration quotidienne de lévodopa. Son poids élevé comparé à d’autres lignées (35-45g à 8 semaines) lui confère une résistance au protocole de lésion unilatérale via la toxine 6-OHDA.
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De plus, son génotype permet de moduler l’activité des cellules de Purkinje de façon simple et donne la possibilité d’altérer l’activité du circuit cérébello-cortical.
En particulier, la région oro-linguale crus II du cervelet, facilement accessible, peut être modulée en regard du développement d’AIMs oro-linguaux induits par la lévodopa chez le modèle parkinsonien. La souris CD1 L7-ChR2 est donc un modèle animal particulièrement adapté à l’étude des stimulations du cervelet pour le traitement des dyskinésies induites par la lévodopa dans la maladie de Parkinson.
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Figure 12 Expression spécifique la ChR2-EYFP dans les cellules de Purkinje de souris L7-ChR2.
Panneau de gauche : observation des cellules de Purkinje exprimant la ChR2-EYFP par microscopie à fluorescence chez une souris adulte.
Panneau de droite : spécificité de la réponse électrophysiologique des cellules de Purkinje comparées aux autres types cellulaires suite à l’illumination bleue.
D’après Chaumont et al., 2013.
Figure 13 Séquence d’inhibition-excitation rebond dans la voie ascendante cérébello-thalamo-corticale suite à l’activation optogénétique des cellules de Purkinje.
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6. Axes de recherche
Un faisceau d’arguments convergents suggère donc que le cervelet est un acteur clef du développement des dyskinésies induites par la lévodopa dans la maladie de Parkinson et que sa modulation présente un axe thérapeutique pour améliorer la qualité de vie des patients.
Toutefois, les mécanismes qui sous-tendent l’effet bénéfique des stimulations cérébelleuses ne sont pas encore clairement identifiés.
Le cœur de mon travail de thèse présenté ci-après a donc eu pour but (1) d’étudier l’implication des cellules de Purkinje dans la réduction des dyskinésies induites par la stimulation cérébelleuse, (2) d’évaluer la possibilité de prévenir l’apparition des dyskinésies oro-linguales par la stimulation des cellules de Purkinje de la région Crus II et (3) de déterminer les possibles modulations du thalamus (VAL et Pf) et du cortex moteur primaire oral (M1o) associées à l’émergence des dyskinésies et l’effet thérapeutique des stimulations du cervelet.
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1. Sujets
Les travaux post-chirurgie ont été effectués chez 75 souris CD1 transgéniques L7-ChR2, mâles, adultes (6-9 semaines, P=35-45 g, issues de l’animalerie centrale de l’Institut de Biologie de l’Ecole Normale Supérieure de Paris (IBENS) ainsi que de l’Institut des Neurosciences Cellulaires et Intégratives de Strasbourg). Les sujets étaient placés dans des cages individuelles, soumis à un rythme jour/nuit de 12h et disposaient d’un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Le projet a été validé par le comité d’éthique de l’IBENS.
2. Protocole longitudinal général
Le protocole consiste en un ensemble d’expérimentations se déroulant durant 10 semaines consécutives où chaque animal est son propre contrôle. Il est précédé d’une PCR et est suivi de contrôles anatomiques et immuno-histochimiques (voir figure 14).
Les animaux débutent ainsi par deux semaines d’habituation où leur comportement basal est évalué. A l’issue de cette période, les sujets subissent une chirurgie lésionnelle (souris 6-OHDA), ou non-lésionnelle (souris sham), et implantatoire suite à laquelle un protocole quotidien de soin est effectué durant 3 semaines. La période dite « parkinson » s’étend ainsi sur trois semaines où le comportement et l’activité électrophysiologique des animaux sont évalués.
A l’issue des trois semaines d’état parkinsonien, les animaux reçoivent une administration quotidienne de lévodopa et ce durant 5 semaines consécutives, il s’agit de la période dite « lévodopa ». Au cours de cette période, les mouvements involontaires anormaux (AIMs), en particulier oro-linguaux, sont évalués en plus du comportement et de l’activité électrophysiologique.
Les animaux sont en outre scindés en quatre groupes distincts (voir tableau 1) : 1) les sujets lésés
recevant les stimulations optogénétiques quotidiennes du cervelet dès le premier jour d’administration de lévodopa (stimulation préventive, 6-OHDAxLDOPAprev) et durant 4 semaines, 2) les sujets lésés recevant des stimulations optogénétiques quotidiennes du cervelet deux semaines après la première administration de lévodopa (stimulation corrective, 6-OHDAxLDOPAcorr) et durant 2 semaines, 3) les sujets ne recevant aucune stimulation optogénétique (6-OHDAxLDOPAnostim) et les animaux contrôles non lésés recevant des stimulations préventives ou correctives groupés dans un seul groupe (SHAMxLDOPAstim).
Enfin, les stimulations optogénétiques sont stoppées la dernière semaine afin d’évaluer l’effet à long terme de la modulation des cellules de Purkinje sur la réduction des AIMs oro-linguaux, le comportement moteur et l’activité électrophysiologique. A l’issue de cette période de 10 semaines
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consécutives, les animaux sont euthanasiés et leur cerveau est extrait. S’en suivent des protocoles de tranche (à l’aide d’un vibratome), d’immunohistochimie et d’imagerie.
Figure 14 Protocole longitudinal.
Expérimentations et soins durant une période de 10 semaines consécutives (S-2 à S8) précédées et suivies d’expérimentations ex vivo.
Groupe Nombre 6-OHDAxLDOPAnostim 16 6-OHDAxLDOPAcorr 23 6-OHDAxLDOPAprev 17 6-OHDAxLDOPAprevcrusI 3 SHAMxLDOPAstim 16
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3. Protocoles péri-chirurgicaux
3.1. Anesthésie et lésion
L’animal à opérer est initialement pesé afin d’adapter les doses de drogues injectées à son poids. Nous procédons ensuite à l’injection sous-cutanée de buprénorphine (un analgésique opiacé) à raison de 0,06 mg/kg. 15 minutes après l’administration de buprénorphine, l’animal est placé 5 minutes dans un caisson saturé en gaz anesthésiant isoflurane (ou bien est anesthésié par injection intrapéritonéale d’une solution de kétamine/xylazine, respectivement 100 mg/kg et 10 mg/kg, fournie par l’animalerie centrale). Nous procédons également à l’injection intrapéritonéale de désipramine (25 mg/kg) afin de protéger les neurones noradrénergiques, ainsi qu’à l’administration de lidocaïne (un anesthésique local) en crème dans chaque oreille. L’animal est ensuite placé dans un cadre stéréotaxique, sur coussin chauffant, où il est maintenu sous anesthésie grâce à un masque délivrant entre 0,75% et 1,5% d’isoflurane (ou bien ne délivrant que de l’air pour favoriser la respiration dans le cas des animaux sous kétamine/xylazine). Après s’être assurés que l’animal est insensible à la douleur, il est rasé et une solution de lidocaïne 2% (0,2 mL) est administrée en sous-cutané au niveau du crâne qui est ensuite minutieusement mis à nu.
Une craniotomie, à l’aide d’une fraiseuse, est effectuée au niveau du faisceau médian du télencéphale (MFB, medial forebrain bundle) (voir tableau 1 et figure 12). Une seringue Hamilton (aiguille de diamètre 30G) est descendue délicatement jusqu’à la zone d’intérêt et laissée durant 2 minutes après quoi l’injection lésionnelle de 6-OHDA (1μL ; 3,2 mg/mL, véhicule = acide ascorbique) ou non lésionnelle d’acide ascorbique (1μL ; 0,2 mg/mL) est effectuée à raison de 0,1μl/min à l’aide d’une pompe automatique afin de limiter les dommages tissulaires. L’aiguille est laissée 2 minutes supplémentaires au terme des 10 minutes d’injection puis délicatement retirée. Les craniotomies des régions d’intérêt sont ensuite effectuées et chaque trou est protégé par un coton imbibé de sérum physiologique. La surface osseuse est ensuite méticuleusement nettoyée, asséchée à l’eau oxygénée et rayée à l’aide d’un scalpel afin d’y appliquer une sous-couche de super-bound (Sun Médical Co. Ltd., Japan) permettant d’optimiser la fixation du ciment dentaire à venir sur la crâne.
Afin d’implanter une LED (diode électroluminescente), nous effectuons une fenêtre d’environ 2 mm² au niveau de la région crus II contra-latérale au MFB injecté (voir tableau 1 et figure 12), en prenant soin de conserver l’intégrité de la dure-mère, sur laquelle nous déposons une goutte de gentamicine (antibiotique local, animalerie centrale) puis une fine couche d’agarose (1%) afin de protéger le cortex cérébelleux. La LED est ensuite fixée sur les parois osseuses de part et d’autre de la fenêtre, au contact de l’agarose, à l’aide de colle transparente puis de ciment dentaire.
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Enfin, au cours de ces travaux les animaux ont été scindés en deux catégories distinctes visant à enregistrer différentes régions.
Ainsi, chez un ensemble de souris, après avoir retiré la dure-mère, des électrodes d’enregistrement cellulaire placées sur un bras stéréotaxique sont délicatement insérées dans le cerveau (M1oral, VAL et Pf) et la terre (ground) placée sous le lambda.
Dans un autre ensemble d’animaux, des électrodes d’enregistrement cortical (électrocorticogramme, EcoG) sont placées dans l’espace extradural sous l’os crânien au niveau des cortex moteurs primaires oraux (M1oral) ipsi- et contra-latéraux au MFB injecté.
Dans chaque catégorie d’implantation, après placement, le ciment dentaire (Pikuplast, Bredent GmbH & Co. KG, Germany) fraichement préparé est ensuite appliqué à l’aide d’une seringue afin de fixer les électrodes et la LED à la surface du crâne, en prenant soin de former une structure « en chapeau » avec le moins d’aspérités possible. L’animal est ensuite suturé si nécessaire, reçoit une injection sous-cutanée de sérum physiologique (0,01 mL/g) ainsi qu’une administration locale de crème antibiotique (Gentamicine, animalerie centrale) et est placé dans une cage propre sur un tapis chauffant où il est surveillé jusqu’à son réveil.
3.2. Protocole de soin
La lésion aigue induite par la toxine 6-OHDA entraîne un risque important de perte animale. Afin d’optimiser la survie, les animaux lésés sont suivis quotidiennement durant trois semaines post-chirurgie. Ainsi, 2 à 3 fois jour, chaque animal est pesé et reçoit une administration sous-cutanée de solution de glucose (50mg/mL ; 0,01mL/g). En outre, une pâte énergétique à base de granulés (animalerie centrale) humidifiés et de lait concentré sucré est mise à disposition ad libitum. De l’eau enrichie en glucose (15%) est également fournie ad libitum. Enfin, les animaux les plus faibles sont nourris manuellement à l’aide de pipettes. De la buprénorphine (0,06 mg/kg) est également administrée quotidiennement durant les deux jours suivant l’implantation.
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4. Enregistrements électrophysiologiques
4.2. Conception des électrodes d’enregistrement cellulaire
Le système d’enregistrement cellulaire placé sur la tête de l’animal est composé d’un micro-connecteur (EIB-16, Neuralynx) de 16 canaux sur lequel nous fixons des canules 29G ou 30G. Chaque canule contient un ensemble de 8 micro-fils torsadés, nommé « bundle » (diamètres respectifs 100 µm, Nickel-Chrome, Sandvik Kanthal, Palm Coast, USA) et est placée de telle sorte que la distance relative des électrodes en bundle soit égale à la distance relative des structures d’intérêt dans le cerveau de l’animal à implanter. Une fois les canules et le ground fixés au micro-connecteur, les bundles y sont placés et chaque canal d’enregistrement est relié à un micro-fil. L’ensemble est recouvert de ciment dentaire protecteur et chaque bundle est coupé en fonction de la profondeur de la structure cible (voir tableau 2). L’extrémité de chaque bundle est en outre biseautée afin d’améliorer la pénétrance dans les tissus et la répartition des zones d’enregistrement. Enfin, peu avant le début de la chirurgie, l’impédance de chaque canal est mesurée et ajustée par électrolyse d’or afin d’être comprise entre 250 et 500 kOhm, permettant un rapport signal / bruit optimal.
Les deux électrodes d’électrocorticogramme (EcoG) quant à elles sont conçues à l’aide de fils de Nickel-Chrome de diamètre 150 µm (Sandvik, Palm Coast, USA) torsadés et dénudés aux extrémités. Ces deux électrodes ont pour but d’enregistrer l’électrocorticogramme des cortex moteurs oraux bilatéraux et sont soudées sur les deux pinoches avant d’un connecteur à 6 entrées. Une électrode similaire est également confectionnée pour servir de ground au connecteur.
4.3. Système d’enregistrements électrophysiologiques
Les enregistrements sont acquis à l’aide du logiciel OpenProject (Tucker Davis Technologies – TDT, USA) par un système RV2 (TDT). La digitalisation se fait au niveau de la tête de l’animal (Headstage Digital TDT) pour éviter le risque d’interférence électrique. La fréquence d’acquisition est de 25 kHz, le filtre passe-haut est fixé à 2000+ Hz et le filtre passe-bas à 300 – 600 Hz. Le connecteur est directement connecté au headstage de digitalisation lui-même branché à un système de suivi du mouvement (swivel, TDT) permettant au câble de ne pas s’enrouler sur lui-même lors des rotations de l’animal enregistré. L’animal est en outre placé dans une cage de Faraday afin de réduire le bruit électrique environnant.
Les potentiels de champs locaux (LFP) et les évènements (spikes) sont extraits du signal brut et analysés offline via une technique de spike sorting réalisée à l’aide d’un programme développé dans l’équipe sous le logiciel Matlab2006Ra. Les spikes sont triés grâce à la technique d’analyse en
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composante principale (PCA) qui permet d’isoler l’activité d’un neurone en recoupant les différentes caractéristiques des signaux analysés telles que la forme et l’amplitude du spike.
Tableau 2 Coordonnées d’injection et de placement des électrodes et de la LED.
Le 0 pour la distance dorso-ventrale est effectué au niveau de la surface osseuse. AP : antéro-postérieur ML : médio-latéral DV : dorso-ventral Région AP ML DV MFB -1,20 -1,30 -4,75 Crus II -6,3 ; -7,7 +2,5 ; +4,1 -
Ground ~ lambda ~ lambda -
Enregistrements cellulaires M1oral +2,20 -2,20 -1 Pf -2,30 -0,75 -3,50 VAL -1,40 -1,40 -3,50 Enregistrements ECoG M1oral +2,2 -2,2 / +2,2 -
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5. Stimulation optogénétique
5.2. Conception des LEDs
La LED permettant d’effectuer la stimulation optogénétique des animaux L7-ChR2 est composée de 3 micro-LEDs (pic λ=465 nm, dimension finale=1,4 x 1,6 mm, angle=110° ; Kingbright Electronic Europe GmbH) soudées entre elles. La LED triple ainsi formée est soudée à deux fils monobrins reliés à un connecteur. Chaque zone possiblement conductrice est ensuite enrobée de vernis isolant et une lamelle de verre extra fine transparente est collée sur la face lumineuse de la LED afin d’assurer une surface parfaitement plane. Chaque LED a une irradiance d’environ 8-10 mW/mm² (puissance-mètre optique, ThorLabs).
5.3. Système de stimulation optique
La LED, préalablement implantée sur la région cérébelleuse d’intérêt de l’animal au cours de la chirurgie, est connectée à un système de stimulation (Universal LED Controler Mightex System, USA) contrôlé par un logiciel (LEDdriver, Mightex). Chaque stimulation lumineuse est ainsi délivrée durant 20ms toutes les 140ms (rythme thêta). Ce protocole quotidien de stimulations dites « thérapeutiques » dure 40s et est répété deux fois à intervalle de 2 minutes (voir figures 14 et 15).
Un autre protocole consiste en la stimulation optogénétique non plastique du cervelet pour l’enregistrement de la réponse électrophysiologique au niveau des régions d’intérêt (M1oral, Pf, VAL). Chaque stimulation dure 100ms et est répétée à un rythme lent de 0,25 Hz durant des sessions de 10 minutes répétées (voir figures 14 et 15).
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Figure 15 Stimulation optogénétique.
Panneau du haut : Stimulation de rythme thêta, chaque session quotidienne dure 40 secondes et est répétée deux fois avec un intervalle de 2 minutes.
Panneau du bas : Stimulation de rythme delta ultra lent, chaque session dure 10 minutes et est répétée entre 2 et 4 fois par semaine.
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