Rationnel
Dans l’actualité, la génération de modèles animaux knockout (KO) est une approche clé pour l’étude et la compréhension de la fonction d’une protéine. La souris KO d’Api5 n’a pas été publiée. A mon arrivée au laboratoire, une lignée de souris invalidées pour un allèle du gène API5 avait été produite par la technique de « gene trap ».
Objectifs
La génération de souris homozygotes pour l’invalidation d’Api5, l’étude du profil d’expression d’Api5 dans les animaux hétéro/homozygotes au cours du développement embryonnaire et à l’âge adulte, ainsi que l’analyse histologique des conséquences de la perte d’Api5 constituaient une grande partie de mon projet de thèse originel.
Matériel et méthodes
La technique « gene trap » consiste en l’insertion aléatoire d’une cassette de sélection dans le génome de cellules ES de souris. La cassette de sélection comporte : un site accepteur
d’épissage en 5’ (modifié pour le rendre fort et titrer la machinerie d’épissage) ; le gène lacZ codant pour l’enzyme b galactosidase ; le gène de résistance à la néomycine, néoR (codant
pour l’enzyme Néomycine Phosphotransferase). Le gène néoR permet la sélection des cellules
ES. L’identification du site d’insertion de la cassette se fait par « Race PCR ». Si l’insertion de la cassette se fait au niveau d’un gène, cela peut conduire à son invalidation. Dans le cas d’une insertion au sein d’un gène, la séquence codante du gène lacZ est épissée avec les exons du gène se trouvant en aval de l’endroit où s’est produite l’insertion. Il en résulte une protéine chimère qui porte quelques premiers acides aminés de la protéine d’intérêt en fusion avec l’enzyme b galactosidase. Cette protéine chimère possède donc l’activité catalytique de la b galactosidase, ce qui permet d’analyser le profil d’expression du gène d’intérêt par coloration X gal à des stades embryonnaires ou adultes.
C’est ainsi que deux lignées de cellules ES ayant intégré la cassette de sélection au niveau du gène API5 ont été générées et identifiées (Figure 36).
Dans la première lignée, l’insertion s’est faite au niveau du 1er intron, ce qui invalide
complètement le gène Api5 (seule une dizaine d’acides aminés, codée par l’exon 1, se retrouve en fusion avec la b galactosidase).
Dans la deuxième lignée, l’insertion s’est faite au niveau du 6ème intron. La protéine
chimère issue de cette insertion comporte la séquence en acides aminés codée par les 6 premiers exons du gène API5 en fusion avec la b galactosidase.
Pour l’étude de la perte de la fonction d’Api5 dans un modèle murin, nous avons choisi de travailler avec la lignée de souris dont l’insertion s’est faite après le 1erexon.
Figure 36. Insertion de la cassette bb Gal au niveau du gène API5 murin. Schéma représentant l’endroit de l’insertion de la cassette de sélection « b Gal/néo », contenant les gènes de la b Galactosidase et de la résistance à la néomycine, au niveau du 1erintron du gène
API5 de la lignée de souris knockout pour Api5. Une deuxième lignée de souris a été générée
Le génotypage des souris hétéro/homozygotes a été fait par PCR à partir de lysats de queue de souriceau (digérée pendant 16h avec de la protéinase K). Les séquences des amorces utilisées pour le génotypage sont : Forward intron 1 5’ ctttagtgtattgtcatgtgca 3’ ; Reverse allèle « Gal/néo » 5’ gcttcactgagtctctggc 3’ ; Reverse allèle sauvage 5’ cacgaccgtaattttaagtcc 3’.
Résultats
A. B.
C.
Figure 37. Caractérisation des souris hétéro/homozygotes du KO API5. (A) Immunohistochimie anti Api5 sur une coupe d’embryon E11/12 de souris hétérozygotes API5 +/b Gal. (B) Coloration X Gal de trois embryons E11/12 de souris sauvages (en blanc) hétérozygotes API5 b Gal/+ (en bleu). (C) Analyse par PCR à 3 amorces du génotype d’embryons à E11/12 issus d’un croissement entre hétérozygotes API5 b Gal/+. La bande d’amplification de taille supérieure est issue de l’allèle sauvage ; inversement, la bande de taille inférieure est issue de l’allèle mutée. Les produits de PCR sont déposés sur gel d’agarose 2%.
Les souris hétérozygotes adultes bgal/+ ne présentent aucune différence par rapport aux souris sauvages. Leur durée de vie et leur fertilité ne semblent pas modifiées.
La réalisation des croisements contrôlés (contrôle et suivi de l’insémination des souris femelles) entre souris hétérozygotes bgal/+ a permis la dissection de plusieurs portées d’embryons à des différents stades de développement. La Figure 37. présente les analyses du profil d’expression d’Api5 dans des embryons de souris à J11/12. (A, immunohistochimie anti Api5 sur une coupe d’embryon ; B, coloration X gal de trois embryons entiers). L’analyse immunohistochimique a été réalisée en collaboration avec le Dr. Céline Basset. Malheureusement, la technique de fixation et de marquage utilisée pour ses études n’était pas adaptée à l’étude histologique des embryons. Le travail de mise au point a été abandonné suite au résultat obtenu par coloration Xgal d’embryons entiers. En effet, le marquage est uniforme sur tout l’embryon, ce qui veut dire qu’Api5 est exprimé dans tous les tissus au cours du développement embryonnaire.
La recherche de souris homozygotes par une technique de PCR à 3 amorces à partir de queues de souriceaux a mis en évidence l’absence de souris homozygotes dans les portées issues du croissement de souris hétérozygotes bgal/+ F1 (Figure 38). Nous avons donc conclu que l’invalidation homozygote de gène API5 était létale.
Figure 38 Résultats des croisements de souris hétéro/homozygotes du KO API5. Représentation non exhaustive des résultats obtenus lors des croisements des différentes générations de souris hétérozygotes API5 b Gal/+, nécessaires à l’obtention et au maintien de la lignée KO API5. (wt = embryons sauvages)
Nous avons alors mis en place plusieurs séries de croisements contrôlés entre souris hétérozygotes bgal/+ et nous avons prélevé les embryons à différents stades de développement (stade E16, E11 et E6). Le but étant de déterminer le stade embryonnaire où
l’absence d’Api5 est délétère pour l’embryon homozygote et provoque sa mort. Cette partie du travail, je l’ai réalisée en collaboration avec le Pr. Bernard Knibiehler, professeur en Biologie du Développement. A notre surprise, le génotypage des embryons E6 de plusieurs portées n’a pas permis d’identifier des homozygotes. Ce résultat montre que la mort de l’embryon homozygote se produit à des stades très précoces du développement embryonnaire. La poursuite de la caractérisation du stade embryonnaire où l’absence d’Api5 empêche le déroulement normal de l’embryogenèse nécessite de travailler avec des embryons de stades très précoces (quelques cellules) ou même des cellules ES. Pour accéder à la technologie et à la connaissance requises pour ce travail, une collaboration devra être mise en place.