DANS LA CELLULE ET DANS UN MODELE MURIN

A API5EST ASSOCIE A DES COMPLEXES PROTEIQUES NUCLEAIRES

Rationnel

En 2006, la publication d’un crible génétique chez la Drosophile a placé Api5 dans la voie apoptotique régulée par E2F1 (Morris et al, 2006). Api5 devenait un inhibiteur spécifique de l’apoptose induite par E2F1, mais aucun mécanisme moléculaire pour cette interaction fonctionnelle n’avait été proposé. De plus, le travail publié ne mentionnait pas la recherche d’une interaction physique entre les deux protéines.

Api5 possède des domaines caractéristiques des facteurs et co activateurs de transcription (motif LXXLL et domaine leucine zipper), souvent retrouvés dans des protéines engagées dans des hétéro/homodimères actifs. Cependant, au début de ma thèse, seule était connue l’interaction spécifique d’Api5 avec les isoformes de haut poids moléculaire du FGF2 (Van den Berghe et al, 2000).

Objectifs

La recherche de protéines partenaires d’Api5 avait été initiée dans un premier but d’identifier un éventuel complexe protéique où E2F1 et/ou son partenaire DP1 seraient associés à Api5. Cette hypothèse s’étant avérée erronée, nous avons entrepris la recherche de

partenaires d’Api5 en réalisant des études bibliographiques, visant des protéines régulatrices associées à E2F1, mais aussi en relation avec les hmwFGF2.

Matériel et méthodes

Les essais d’extraction de protéines associées à la chromatine, d’immunoprécipitation de complexes protéiques, les analyses par Western blot et l’immunofluorescence ont été réalisés comme décrit dans l’article (Garcia Jove et al, soumis).

L'appartenance d’Api5 à différents complexes protéiques a été analysée en migrant des extraits protéiques nucléaires non dénaturés sur un gradient de 10% à 50% de glycérol. La migration des extraits est réalisée sur 16 heures en utilisant une ultracentrifugeuse. Les fractions du gradient de glycérol ont été recueillies par pipetage répété d’un volume constant. Les différentes fractions ont alors été analysées par Western blot, à la recherche de la présence d’Api5. Cette partie du travail a été faite en collaboration avec le Pr. Gérard Bouche.

Résultats

L’étude de l’appartenance d’Api5 à différents complexes protéiques a été faite en migrant des extraits protéiques nucléaires non dénaturés de cellules 3T3 et MCF7, sur un gradient de 10% à 50% de glycérol. Les extraits protéiques sont issus de la fraction recueillie après un lavage à 0,4M de NaCl à partir de noyaux entiers (cf. extraction de protéines associées à la chromatine) (Figure 27 A). Dans ce procédé non dénaturant, les protéines sous forme libre ou non engagées dans des complexes protéiques migrent dans les zones peu denses, de faible pourcentage en glycérol. Inversement, les complexes protéiques migrent dans des zones plus denses du gradient, de forte concentration en glycérol. Un total de 20 fractions de concentration croissante en glycérol a été recueilli. L’analyse par Western blot montre qu’Api5 est majoritairement retrouvé dans les fractions 1 et 7 dans les cellules MCF7 et dans les fractions 3 et 9 dans les cellules 3T3 (Figure 27 B). Ce résultat est un argument en faveur de l’appartenance d’Api5 à un complexe protéique nucléaire, mais aussi en faveur de l’existence d’Api5 en tant que monomère.

A. B.

Figure 27. Api5 est associé à des complexes protéiques nucléaires. (A) Les protéines associées à la chromatine ont été extraites par des traitements croissants en concentrations de NaCl, à partir de noyaux entiers de cellules 3T3 ou MCF7. (B) La fraction extraite avec 0,4M de NaCl a ensuite été migrée dans un gradient de glycérol en conditions non dénaturantes. 20 fractions, correspondant à des zones de différente densité, ont été collectées. La présence d’Api5 dans différentes fractions du gradient a été analysée par Western blot.

La recherche de partenaires protéiques d’Api5 s’est faite par des expériences de co immunoprécipitation à partir de noyaux de cellules HeLa. Les cellules HeLa avaient été préalablement transfectées par un plasmide « taptag » vide ou contenant l’isoforme de 504aa d’Api5 en fusion avec une étiquette HA, utilisée pour l’immunoprécipitation. Les fractions immunoprécipitées ainsi que les extraits utilisés pour l’essai (Input) ont été analysées par Western blot (Figure 28). L’approche est validée par l’immunoprécipitation des hmwFGF2 avec HA Api5. Trois nouveaux partenaires ont été identifiés par cette approche : les ubiquitines E3 ligases MDM2 et VHL, et le récepteur ERa (WB non montré).

Figure 28. Le FGF2 et les E3 ubiquitine ligases MDM2 et VHL interagissent avec Api5 dans les noyaux des cellules HeLa. Analyse par Western blot des fractions immunoprécipitées avec un anticorps anti HA à partir d’extraits nucléaires de cellules HeLa transfectées avec un vecteur « taptag » vide ou contenant l’isoforme de 504aa d’Api5 en fusion avec une étiquette HA. (Input = extraits bruts utilisés pour l’immunoprécipitation)

Figure 29. Api5 colocalise avec le FGF2 et MDM2 au niveau des noyaux des cellules HeLa. Analyse de la localisation cellulaire d’Api5 (en vert), FGF2 (série du haut, en rouge) et MDM2 (série du bas, en rouge) dans des cellules HeLa par Immunofluorescence. Les foyers jaunes correspondent à la colocalisation entre Api5/hmwFGF2 (formes nucléaires) et Api5/MDM2. Les noyaux ont été colorés avec de l’iodure de propidium (IP, en bleu). Echelle : 10µm.

MDM2 est principalement connu pour être l’E3 ubiquitine ligase responsable de l’adressage au protéasome de la protéine p53. Cependant MDM2 est aussi capable de reconnaître et interagir avec E2F1. Contrairement à l’interaction MDM2/p53, la liaison entre MDM2 et E2F1 n’induit pas la dégradation de la protéine E2F1 mais la stabilise (Zhang et al, 2005) . L’appartenance d’Api5 et MDM2 à un même complexe s’avère une piste intéressante pour la compréhension de l’interaction fonctionnelle entre Api5 et E2F1.

La validation de l’interaction entre MDM2 et Api5 s'est alors poursuivie par des expériences de colocalisation à partir des protéines endogènes dans les cellules HeLa. L’analyse a été faite par microscopie confocale (Figure 29). Encore, les hmwFGF2 ont été utilisées comme contrôle positif. Les essais d’immunofluorescences montrent que le marquage d’Api5 se superpose avec celui des hmwFGF2 à certains endroits (foyers jaunes) dans le noyau des cellules. Ce résultat est surprenant du fait que l’interaction entre ces deux protéines est directe (Van den Berghe et al, 2000). Le même type d’observation est faite pour la colocalisation d’Api5 et MDM2. Les résultats obtenus confirment l'interaction, directe ou indirecte, de MDM2 avec Api5.

Notre démarche pour caractériser l’association entre Api5 et MDM2 s’est orientée vers la définition de la nature de l’interaction, directe ou indirecte. Dans ce sens, nous avons mis en place des essais GST pull down avec des protéines recombinantes produites au laboratoire. Cependant dans nos essais, l’interaction avec le FGF2.24 apparaissant bien comme directe, l’interaction avec MDM2 s’est avérée non directe (résultats non présentés).