Rôle de Api5 dans la régulation transcriptionnelle par E2F1.

Api5 est une protéine initialement identifiée dans l’équipe comme partenaire direct des formes nucléaires du FGF2 (les hmwFGF2), impliquées dans la prolifération cellulaire et l’oncogenèse (Van den Berghe et al, 2000). En parallèle à ce travail, Api5 a été identifié comme facteur de survie, inhibant l’apoptose des cellules dans un milieu pauvre en sérum, et comme facteur stimulant le pouvoir invasif de cellules cancéreuses cervicales (Kim et al, 2000; Tewari et al, 1997).

L’intérêt de l’équipe pour la protéine Api5 a été renouvelé suite à la publication en 2006 d’un travail sur le modèle de la Drosophile (Morris et al, 2006). Dans cette étude, les auteurs ont mis en place un crible génétique in vivo pour identifier des modificateurs de l’apoptose induite par le facteur de transcription E2F1. Ce crible a permis l’identification d’Api5 en tant qu’inhibiteur de la voie apoptotique d’E2F1. L’étude poursuivie in vitro, dans des cellules humaines Saos 2 (p53 et pRb nulles), montre qu’Api5 protège les cellules de l’apoptose dans un contexte de surexpression d’E2F1, mais que cet effet ne passe pas par une inhibition de l’activité transcriptionnelle d’E2F1. Cependant, les auteurs ne discutent pas le fait que dans des conditions de surexpression d’E2F1, la co surexpression d’Api5 semble

augmenter les niveaux protéiques des cibles transcriptionnelle d’E2F1. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire pour l’interaction génétique entre Api5 et E2F1 n’a été proposé.

A mon arrivée au laboratoire en 2007, nous avons conçu un projet de recherche ayant pour but l’étude de la relation entre E2F1, Api5 et les hmwFGF2.

L’étude biochimique et des domaines structuraux conservés de la protéine Api5 a révélé qu’Api5 possède plusieurs domaines de reconnaissance et d’interaction protéine protéine (motif LXXLL, régions organisées hydrophobes et un domaine leucine zipper) normalement retrouvés dans des co facteurs et facteurs de transcription (Van den Berghe et al, 2000). De plus, un domaine de transactivation putatif est retrouvé au sein de la structure d’Api5.

Api5 est une protéine nucléaire qui, en immunofluorescence, révèle un marquage ponctuel exclu de l’hétérochromatine, suggérant qu’elle pourrait appartenir à des entités nucléaires fonctionnelles. Par des extractions salines à partir de noyaux cellulaires entiers, nous avons montré qu’Api5 est une protéine fortement associée à la chromatine. Ce premier résultat, avec les données bibliographiques, nous a mis sur la piste d’un possible rôle d’Api5 au niveau de la chromatine, avec des conséquences sur l’activité transcriptionnelle d’E2F1.

Le facteur de transcription E2F1 joue un rôle clé dans le devenir de la cellule. Par son activité transcriptionnelle, il peut déclencher et contrôler la progression du cycle cellulaire, mais peut aussi induire l’apoptose (Iaquinta & Lees, 2007). J’ai analysé le comportement d’Api5 lors de ces deux processus cellulaires. Dans un premier temps, je ferai le point des résultats obtenus sur la relation d’Api5 et E2F1 dans des conditions « physiologiques » du cycle cellulaire, puis dans des conditions de stress génotoxique. Après cela, je discuterai les résultats obtenus sur le mécanisme moléculaire de l’interaction fonctionnelle entre Api5 et E2F1.

Api5 et cycle cellulaire.

Par des expériences de synchronisation cellulaire, j’ai observé qu’Api5 est une protéine régulée au cours du cycle cellulaire. Ce type d’expression cyclique est très commun parmi les régulateurs du cycle cellulaire et E2F1, lui même, y est sujet (Wang et al, 2006). De plus, de façon très intéressante, les deux protéines Api5 et E2F1 présentent un profil d’expression

similaire au cours du cycle cellulaire. A noter, les deux protéines atteignent un pic d’expression en fin de phase de G1 et en début de phase S alors qu’elles voient leur niveau diminuer en phase G2 (l’expression d’E2F1 reste plus stable que celle d’Api5 au cours de la phase S) pour presque disparaître en mitose. Les niveaux des deux protéines, Api5 et E2F1, sont diminués dans les cellules quiescentes, alors qu’après stimulation mitogène, leur synthèse de novo permet une accumulation importante en approche du point de restriction et en fin de phase G1.

A partir des données sur la régulation de la protéine Api5 au cours du cycle cellulaire, je me suis intéressée au rôle d’Api5 dans la transcription de cibles pro mitotiques d’E2F1 et obtenu des résultats intéressants. La déplétion d’Api5 diminue de façon significative les niveaux de transcrit de plusieurs cibles transcriptionnelles d’E2F1 nécessaires à la transition G1/S du cycle cellulaire. Au niveau cellulaire, la déplétion d’Api5 provoque une accumulation des cellules en phase G1, au détriment de la phase S, ainsi qu’un retard de croissance. Les observations faites lors de la déplétion d’Api5 sont équivalentes à celles faites avec une déplétion d’E2F1. Ces résultats démontrent un rôle clé d’Api5 dans la transition G1/S du cycle cellulaire. Api5 semble participer à l’expression de certains gènes pro mitotiques dépendants d’E2F1.

Au moment de la transition G1/S du cycle cellulaire, E2F1 est aussi retrouvé au niveau de promoteurs de gènes pro apoptotiques et stimule l’expression de certaines caspases et de protéines à domaine BH3 seul (Hershko & Ginsberg, 2004; Nahle et al, 2002). Par la stimulation périodique de l’expression de gènes pro apoptotiques au cours du cycle cellulaire, E2F1 préparerait la cellule à l’apoptose en réponse à un possible événement délétère, survenu au moment de la synthèse et réplication de l’ADN ou de la ségrégation des chromosomes. Il m’a semblé alors intéressant d’analyser l’effet d’Api5 sur ces cibles pro apoptotiques régulées lors de la transition G1/S. J’ai observé que, comme pour certains gènes pro mitotiques contrôlés par E2F1, Api5 est nécessaire à la bonne expression de certaines cibles pro apoptotiques d’E2F1, dont l’expression est normalement activée aux abords de la transition G1/S.

Mon travail s’est fait sur des cellules HeLa asynchrones traitées avec des siARN dirigés contre E2F1 ou Api5. Dans les deux cas, j’ai observé une diminution du niveau de transcrit de la caspase activatrice 9 mais une augmentation du niveau des transcrits des caspases effectrices 3 et 7. Ce résultat signifierait que, dans notre modèle cellulaire, E2F1 et Api5

régulent positivement l’expression de la caspase 9 et négativement celle des caspase 3 et 7. Les travaux qui ont mis en évidence la régulation des caspases par E2F1, montrent une accumulation de la caspase 9 au cours de la phase S, mais aussi une accumulation des caspases 3 et 7 (Nahle et al, 2002). La différence entre leur résultat et le mien pourrait être expliquée par l’approche expérimentale. Dans notre étude j’ai travaillé avec des cellules HeLa asynchrones, alors que dans l’étude de Nahle et al., les cellules IMR90 (lignée cellulaire embryonnaire humaine de poumon) utilisées ont été synchronisées par privation de sérum. Les deux expériences, et donc les résultats issus, sont difficilement comparables. Mes résultats sur l’expression de cibles apoptotiques d’E2F1 ne montrent pas une régulation d’Api5 et d’E2F1 à un moment donné du cycle, mais une régulation globale. Il est possible que de façon générale, dans une population cellulaire asynchrone, E2F1 et Api5 stimulent la transcription de caspases effectrices tels que la caspase 9, mais verrouillent la transcription des caspases activatrices 3 et 7, plus en aval dans la cascade d’induction de l’apoptose.

Dans mon travail, j’ai fait une extrapolation du moment du cycle cellulaire où Api5 exerce sa régulation à partir :

(1) du pic d’expression de la protéine (au moment de la transition G1/S) ;

(2) de la nature des cibles trancriptionnelles d’E2F1 qui ont été identifiées comme affectées par la dépletion d’Api5 (toutes étant des cibles activées par E2F1 au moment de la transition G1/S) ;

(3) de l’effet de la déplétion d’Api5 au niveau cellulaire (qui consiste en une forte accumulation des cellules en phase G1 du cycle cellulaire).

En conséquence, mes résultats sur le rôle d’Api5 dans la progression du cycle cellulaire pourraient être complétés par une approche de synchronisation cellulaire combinée à des siRNAs, afin de visualiser la régulation par Api5 et par E2F1 à des stades précis du cycle cellulaire.

Une expérience intéressante, qui élargirait la portée de notre étude, consisterait comparer la croissance tumorale de cellules traitées avec des ARNs interférents dirigés contre Api5, E2F1 ou contrôle. En effet, nous avons mis en évidence une accumulation des cellules en phase G1, quand celles ci sont traitées avec un siARN dirigé contre Api5 (ou E2F1, en tant que contrôle positif), ainsi qu’un retard de croissance. Cependant, nous ne savons pas si à long terme ce traitement aurait des conséquences sur la tumorigenèse. Pour étudier cela, il faudrait de préférence travailler avec des lignées en conditions de transfection stable avec des shARNs.

La génération de lignées stables exprimant un shARN dirigé contre Api5 (de façon non inductible) avait déjà été testée selon une approche de transduction lentivirale. Il m’a été impossible d’établir ces lignées à partir de cellules HeLa et H1299. Il est possible d’envisager que le rôle de Api5 dans la prolifération et la croissance des cellules HeLa et H1299 soit essentiel, puisque sa perte ne peut être sélectionnée. Il serait donc recommandé de travailler avec des promoteurs inductibles. Cependant, plus récemment, nous avons réussi à établir différentes lignées de cellules MCF7 exprimant un shARN dirigé contre Api5 selon la même approche. Les résultats préliminaires laissent entrevoir que les lignées de cellules MCF7, où l’expression de Api5 a été abolie, présentent un retard important de croissance et sont incapables de developper des tumeurs chez la souris nude. Ces observations vont dans le sens de notre hypothèse et nos résultats sur le rôle de Api5 dans la prolifération et l’entrée en cycle cellulaire.

Api5 et apoptose.

Dans des conditions de stress génotoxique court ou prolongé, la quantité de protéine Api5 augmente par rapport au contrôle en analyse Western blot. De même, en immunofluorescence, le marquage ponctuel nucléaire d’Api5 est modifié suite à un traitement génotoxique : le nombre de foyers d’Api5 observés est fortement augmenté. Cela nous fait supposer qu’Api5 pourrait être jouer un rôle dans la détection ou la réponse dommages à l’ADN. Des approches biochimiques seraient nécessaires pour compléter les observations : l’identification de partenaires d’interaction d’Api5 spécifiques des conditions de stress génotoxique, l’étude d’une synthèse de novo ou de modifications post traductionnelles en réponse aux dommages à l’ADN...

Initialement, j’ai testé la possibilité qu’Api5 soit associé (1) aux « PML bodies » structures subnucléaires macromoléculaires permettant l’ancrage de facteurs intervenant dans la réplication, la transcription et l’extinction épigénétique (Stuurman et al, 1990) ; (2) au complexe d’élongation de la transcription la relocalisation du marquage d’Api5 se fait principalement en réponse à un traitement par l’étoposide, inhibiteur de la topoisomérase II qui bloque et stabilise les complexes d’élongation de la transcription, entre autres. Cependant, des analyses de co localisation ont montré que ces hypothèses sont négatives.

Actuellement nous envisageons une possible relocalisation d’Api5 au niveau des foyers d’histone gH2AX phosphorylée, aux abords des cassures double brin de l’ADN. Des premières

données montrent qu’en conditions normales, Api5 ne co localise pas avec gH2AX phosphorylée, mais qu’en présence d’un stress génotoxique, les marquages des deux protéines se superposent en partie. Encore, il faut traiter, reproduire et approfondir ces résultats afin de savoir s’ils ont une vraie signification biologique. Si les observations faites sont validées, il faudra travailler avec d’autres senseurs et messagers de la machinerie de signalisation et réparation des dommages à l’ADN (RPA, PARP1, BRCA1, DNA PK, ATM/ATR, Chk1/2), afin de compléter les résultats et d’établir le rôle d’Api5 dans le processus de surveillance de l’intégrité génétique.

A partir des résultats obtenus sur la régulation de la protéine Api5 en conditions de stress génotoxique, je me suis intéressés au rôle d’Api5 sur la transcription de cibles pro apoptotiques d’E2F1, sous traitement génotoxique ou pas. Api5 ayant été décrit comme inhibiteur de l’apoptose dépendante d’E2F1, je m’attendais à avoir un effet d’Api5 sur l’expression de cibles pro apoptotiques d’E2F1. Cependant, Api5 ne semble pas nécessaire à l’expression de cibles pro apoptotiques spécifiquement induites par E2F1 en réponse à des dommages à l’ADN. Ce résultat peut être simplement expliqué par une spécificité d’Api5 vis à vis des cibles transcriptionnelles d’E2F1 normalement régulées au cours du cycle cellulaire. Au cours d’un stress génotoxique, la protéine E2F1 s’accumule (Blattner et al, 1999; Hofland et al, 2000) et il semble que son activité transcriptionnelle est redirigée au niveau des cibles pro apoptotiques (Pediconi et al, 2003). Il est possible que ce ne soit pas le cas pour Api5.

Mécanisme moléculaire de l’interaction fonctionnelle entre Api5 et E2F1.

Un aspect important de mon projet de thèse était la recherche du mécanisme moléculaire par lequel Api5 inhibe l’apoptose induite par E2F1 ; mais également la recherche du mécanisme par lequel Api5 contribue à expression de gènes impliqués dans la transition G1/S du cycle cellulaire, dépendants d’E2F1.

Notre première hypothèse de travail était l’appartenance d’Api5 et E2F1/DP1 ou pRb à un même complexe, mais elle s’est avérée invalide.

La forte association d’Api5 à la chromatine nous a amené à explorer la possibilité qu’Api5 se retrouve associé aux promoteurs cibles d’E2F1. Cependant l’analyse par

Immmunoprécipitation de Chromatine (ChIP) de liaison d’Api5 à différents promoteurs cibles d’E2F1, n’a pas mis en évidence une association d’Api5 à ces promoteurs. Ce travail a demandé un grand effort quant à la mise au point des différentes approches utilisées. Un résultat négatif dans une expérience de ChIP couplée à de la qPCR ne reflète pas obligatoirement une absence de liaison de la protéine d’intérêt à l’ADN. En effet, l’anticorps utilisé, les conditions de fixation des complexes protéiques à la chromatine et la région du promoteur analysée influencent de façon importante le résultat et constituent parfois une limite de l’approche. Etant consciente de cela, j’ai mis au point trois approches différentes :

1) Ne savant pas si l’anticorps anti Api5, dont on disposait, était compatible avec l’expérience de ChIP, j’ai cloné les ADNc d’E2F1 et Api5 (504aa) dans un vecteur d’expression en fusion avec l’étiquette HA. Ainsi, après transfection, l’immuno précipitation des deux protéines pouvait se faire avec un même anticorps et les profils d’association à la chromatine devenaient comparables.

2) J’ai envisagé une liaison indirecte d’Api5 à l’ADN. Dans le cas de l’analyse de complexes associés à la chromatine, il est possible d’utiliser différents agents fixateurs et de faire des mises au point au niveau du temps d’incubation et des concentrations d’agent fixateur à employer.

3) Au moment de la transcription, la chromatine « ouverte » peut s’organiser en une structure secondaire plus ou moins complexe. Deux sites lointains au niveau de la séquence primaire peuvent se retrouver à proximité après structuration de la molécule d’ADN. Selon cette idée, j’ai cherché la présence d’Api5 sur plusieurs Kb en amont et en aval du site de fixation d’E2F1 au niveau des promoteurs cibles.

Comme j’ai annoncé précédemment, ces approches ont donné des résultats négatifs. Api5 semble non associée aux promoteurs cibles d’E2F1.

Cependant, les expériences de ChIP ont démontré que lors des événements précoces d’un stress génotoxique, la surexpression d’Api5 stimule fortement le recrutement d’E2F1 au niveau des promoteurs cibles. Api5, n’étant pas retrouvé dans un même complexe avec E2F1 ni au niveau des cibles promotrices d’E2F1, doit exercer son rôle dans le recrutement d’E2F1 de façon indirecte.

En réponse à un traitement génotoxique, nous avons observé une accumulation nucléaire importante d’Api5. Il est envisageable qu’Api5 s’associe et active des histones acétylases ou bien des méthyle transférases qui vont induire des modifications épigénétiques

de la chromatine, ou même la modification post traductionnelle d’E2F1. Il a été montré que l’acétylation d’E2F1 par P300 et P/CAF en conditions de stress génotoxique stimule l’activité transcriptionnelle d’E2F1, en renforçant son recrutement au niveau des promoteurs. Cependant cette modification post traductionnelle semble affecter le choix des promoteurs cibles, en dirigeant E2F1 vers ses cibles pro apoptotiques (Martinez Balbas et al, 2000; Pediconi et al, 2003). Le rôle de l’acétylations d’E2F1 dans un contexte de cycle cellulaire n’a pas encore été démontré. Dans notre travail, sous des conditions de stress génotoxique, nous avons quand même observé une accumulation du transcrit de la Cycline E. Ceci pourrait signifier que malgré la présence de dommages à l’ADN, des facteurs de survie tels qu’Api5 poussent la cellule à la survie et à la poursuite du cycle cellulaire.

Ces mêmes expériences de ChIP ont montré que de façon contradictoire, en dehors d’un stress génotoxique, la surexpression d’Api5 diminue le recrutement d’E2F1 au niveau de ses cibles promotrices. Api5 est une protéine pouvant subir des acétylations (Choudhary et al, 2009). Il a été montré que certaines enzymes acétylases ont une activité spécifique dans des conditions de stress génotoxique, notamment dans l’acétylation d’E2F1 (Galbiati et al, 2005; Ianari et al, 2004). Il est possible qu’Api5 soit un « senseur » des dommages à l’ADN qui nécessite une acétylation pour être activé et exercer son rôle de facteur de survie/anti apoptotique. Les caspases ont un comportement similaire : leur accumulation sensibilise à l’apoptose, mais sans la déclencher car elles s’accumulent sous forme inactive. Ainsi l’accumulation d’Api5 sous forme non activée pourrait entraîner un encombrement stérique par son association à la chromatine et avoir ainsi un effet négatif sur la liaison d’E2F1 à l’ADN, de façon non spécifique ; alors que dans un contexte de stress génotoxique, Api5 est activé et répond de façon adaptée au stress cellulaire. Comme critique à ces expériences de ChIP, il me semblerait essentiel d’étudier les effets des traitements d’étoposide et de la surexpression d’Api5 sur sa liaison à l’ADN d’un facteur de transcription autre qu’un E2F, en tant que contrôle négatif. Pour tester l’hypothèse du rôle de l’acétylation d’Api5 (ou de la phosphorylation) en réponse à un stress génotoxique, nous pourrions mettre en place une approche avec des mutants ponctuels au niveau des résidus concernés par les modifications post traductionnelles d’Api5.

Il est également envisageable qu’Api5 stimule la transcription d’un modulateur de l’activité d’E2F1 dans des conditions de stress. Cependant, notre approche se faisant sur des temps très courts de traitements génotoxiques (4 heures) semble invalider cette possibilité. Par ailleurs, il est possible que dans des conditions de stress génotoxique, Api5 recrute ou

stimule la formation de complexes protéiques spécifiques, qui recrutent à leur tour E2F1 au niveau des promoteurs. Pour répondre à ces questions, des approches plus générales visant à identifier les interactants d’Api5 par spectrométrie de masse, ou à identifier les régions d’ADN reconnues par Api5 par ChIP sequencing, apporteraient des grandes quantités d’informations.

Enfin, il me semble important de discuter succinctement la série de résultats négatifs ou non significatifs que nous avons obtenu lors de l’étude menée sur la régulation par Api5 de l’activité transcriptionnelle d’E2F1 et sur l’activité anti apoptotique d’Api5.

La déplétion d’Api5 provoque une diminution des niveaux de transcrit de plusieurs cibles transcriptionnelles d’E2F1 de la transition G1/S du cycle cellulaire. Cependant la surexpression d’Api5 n’a aucune conséquence à ce niveau là. Le même type de réponse est retrouvé avec la déplétion et surexpression d’E2F1. Notre approche n’était peut être pas adaptée à l’étude de l’activation transcriptionnelle par E2F1 (et par Api5). En effet, les cellules étaient récupérées 12h, 24h et 48h après la transfection transitoire de nos vecteurs d’expression et dans le cas de la surexpression d’E2F1, il y avait une apoptose importante. Le travail sur E2F1 se fait normalement en expression stable et inductible et dans ces conditions, le pic d’activation transcriptionnelle semble se faire à des temps plus courts (Morris et al, 2006). Quant à Api5, le fait que sa surexpression n’induise pas l’accumulation des transcrits pro mitotiques est en accord avec l’absence de données bibliographiques lui accordant une fonction pro proliférative. La surexpression d’Api5 ne semble pas suffisante pour activer la transcription de gènes.

Pour finir, les mises au points faites pour l’étude de l’inhibition de l’apoptose par Api5 suite à des traitements génotoxiques sont restés préliminaires en raison de la publication, en parallèle à mes travaux, d’une étude qui traite en partie sur ce sujet (Rigou et al, 2009). Nos travaux ont commencé par une approche où Api5 était surexprimé en présence ou absence d’un traitement d’étoposide. L’étoposide est décrite comme activant spécifiquement la voie