Rationnel
Plusieurs isoformes d’Api5 de taille variable ont été répertoriées dans les banques de données informatiques. Cependant les seules isoformes d’Api5 utilisées dans les travaux publiés chez l’Homme sont celles de grande taille, lesquelles semblent jusqu’à maintenant avoir des propriétés et des comportements similaires.
Avant de définir les cellules HeLa et H1299 comme modèle cellulaire pour mon étude sur la relation entre Api5 et E2F1, j’ai travaillé avec plusieurs lignées cellulaires (Y79, 3T3, MCF7, HEK). J’ai utilisé également différents anticorps anti Api5 (produits au laboratoire ou commerciaux, monoclonaux ou polyclonaux) et différents ARNs interférents. J’ai observé en Western blot une grande variété de formes d’Api5 de taille différente. De façon intéressante, les H1299 présentent une isoforme majoritaire d’environ 40kDa de localisation exclusivement cytoplasmique. Cette isoforme fait penser au clone C1 initialement cloné par Van den Berghe et al. en 2000.
Objectifs
Ces étapes de mise au point ont cherché à déterminer quelles étaient vraiment les isoformes exprimées dans les lignées tumorales.
La recherche de différentes isoformes protéiques d’Api5 a débuté in silico, puis s’est poursuivie par une stratégie de clonage et séquençage à façon, à partir d’ADNc des lignées cellulaires HeLa, H1299 et MCF7. Le but était d’isoler et cloner différentes isoformes d’Api5, de les identifier par rapport aux formes répertoriées dans les banques informatiques et d’étudier leurs comportements, probablement différents en fonction des domaines protéiques compris dans leur séquence.
Matériel et méthodes
La mesure des activités luciférase Firefly et Renilia a été réalisée à l’aide du kit Dual Luciferase® Reporter Assay System (Promega) selon les indications du fournisseur.
La stratégie de clonage et séquençage à façon à partir d’ADNc des lignées cellulaires HeLa, H1299 et MCF7 comporte plusieurs étapes :
1) génération des ADNc par Reverse Transcription (RT) des ARNs totaux de cellules HeLa, H1299 et MCF7 en utilisant une amorce oligodT ;
2) amplification spécifique de certains de ces ADNc par PCR en utilisant des amorces sens, en amont de deux codons AUG identifiés (au niveau du 1eret 4èmeexon d’Api5), et des amorces
anti sens, en aval des codons Stop des isoformes 504/510aa, identifiées préalablement (Van den Berghe et al, 2000) ;
3) clonage des produits d’amplification obtenus dans un vecteur navette pSCB (Stratagene) puis séquencés à façon ;
4) étude in silico des différentes isoformes clonées, identification des épissages qui ont généré les différentes isoformes clonées et comparaison aux données déjà existantes dans les banques informatiques. L’identification d’un troisième type d’épissage au niveau du dernier exon a permis la caractérisation d’une isoforme de 524aa et le design d’une amorce anti sens spécifique au niveau du codon Stop.
5) clonage des isoformes dans les vecteurs d’expression « taptag » et pEGFP (Clontech) afin d’étudier leur comportement dans la cellule.
Les analyses par Western blot, Immunofluorescence et l’extraction de protéines associées à la chromatine ont été réalisées comme décrites précédemment (Garcia Jove et al, soumis).
Résultats
L’étude de la séquence des isoformes de grande taille d’Api5 de 504 et 510aa a permis d’identifier une deuxième méthionine, entourée d’un bon consensus de la séquence Kozak, situé à 126aa en aval de la première méthionine et en phase avec celle ci (Figure 30 B). La traduction à partir de cette méthionine permettrait la génération de protéines Api5 tronquées naturellement de leur extrémité N terminale. J’ai alors étudié la possibilité de l’existence d’un promoteur alternatif en amont ce deuxième codon Start situé dans le 4èmeexon du gène API5.
Pour cela j’ai cloné des régions de 1000pb des introns 3 et 4, juste en amont des exons 3 et 4 respectivement, dans un vecteur pGL3. Dans le vecteur pGL3, l’expression de la luciférase Firefly est sous la dépendance de la séquence clonée en amont.
A.
B.
Figure 30. Le gène API5 possède un promoteur interne au niveau du 3èmeintron qui peut initier la transcription d’un ARNm qui possède un codon AUG en phase avec celui d’Api5 pleine taille. (A) Mesure de l’activité de la luciférase Firefly rendant compte de l’activité transactivatrice de la séquence clonée en amont de son gène dans le vecteur pGL3 (Promega). Le vecteur pGL3 est vide ou porte des fragments de 1000pb des introns 3 et 4 du gène API5 humain, juste en amont des exons 3 et 4 respectivement. L’activité Firefly est normalisée par rapport à l’activité de la luciférase Renilia, exprimée sous le contrôle du promoteur CMV dans un vecteur cotransfecté avec les différents contructions pGL3. (B) Séquence de l’ADNc codant pour la forme de 504aa d’Api5 humain. Les deux codons d’initiation en phase sont soulignés.
Cette expérience a permis de mettre en évidence l’existence d’un promoteur alternatif au niveau du 3ème intron du gène API5 (Figure 30 A). Ce résultat ouvre la possibilité de
trouver des isoformes protéiques d’Api5 de séquence identique à Api5 pleine taille mais tronquées en N terminal car leur traduction est initiée au niveau de la deuxième méthionine identifiée.
La stratégie de clonage et séquençage d’isoformes d’Api5, isolées par PCR à partir de RT des ARNs totaux de cellules HeLa, H1299 et MCF7, a permis l’identification de 11 isoformes d’Api5 (Figure 31). Trois épissages alternatifs en 3’ de l’ARN d’Api5 génèrent trois « familles » de protéines Api5 : de 524, 504 et 510aa, avec une divergence de séquence dans leur extrémité COOH. Les isoformes terminant par une « extrémité 524 » n’ont été retrouvées que dans les cellules H1299. Les isoformes terminant par des « extrémités 504 et 510 » ont par contre été retrouvées dans les trois lignées cellulaires HeLa, H1299 et MCF7.
B.
C.
Figure 31. Isoformes d’Api5 isolées et clonées par RT PCR. Les différentes isoformes d’Api5 ont été isolées par PCR à partir de RT des ARNs totaux de cellules HeLa, H1299 et MCF7. Les PCR ont été faites avec des amorces sens, en amont des deux ATG (du 1eret 4ème
exon), et avec des amorces anti sens, en aval des codons Stop des isoformes 504aa (A) et 510aa (B), identifiées préalablement. Les ADNc obtenus ont étés clonés puis séquencés à façon, pour être étudiés in silico. L’identification d’un troisième type d’épissage au niveau du dernier exon a permis la caractérisation d’une isoforme de 524aa (C) et le design d’une amorce anti sens spécifique au niveau du codon Stop.
Les différentes isoformes peuvent être assimilées à des variants naturels, qui possèdent ou excluent des domaines fonctionnels de la protéine Api5 pleine taille (impliqués dans son activité, son interaction avec d'autres molécules, sa localisation...) (Figure 31). Nous avons alors émis l'hypothèse de l'existence de différents rôles associés aux différentes isoformes d’Api5, en fonction des domaines fonctionnels retrouvés dans leur séquence. Pour pouvoir utiliser les différentes isoformes d’Api5 en tant que « mutants naturels » des formes de grande taille, nous avons cloné les 11 isoformes identifiées dans le vecteur d’expression « taptag », en fusion avec une double étiquette « HA » et « flag », et dans le vecteur d’expression pEGF C1, en fusion traductionnelle avec l’EGFP. L’analyse par Western blot et par microscopie confocale de ces outils est montrée dans les Figures 33 et 34.
Figure 32. Isoformes d’Api5 isolées et clonées par RT PCR. Représentation schématique des domaines protéiques inclus et exclus dans les différentes isoformes, par l’utilisation des deux promoteurs du gène API5 et suite aux différents épissages de l’ARN d’Api5.
A.
B.
Les isoformes de petite taille (275 et 278aa) ne possèdent pas le domaine leucine zipper ni la NLS, ce qui leur confère une localisation cytoplasmique (Figure 34). Les isoformes de 352 et 398aa, initiées à la deuxième méthionine, ne possèdent pas le motif LXXLL ni le premier domaine de liaison aux hmwFGF2 et semblent très stables. Plusieurs isoformes apparaissent sous formes de doublets (et même présentent plusieurs bandes) lors de l’analyse par Western blot avec des anticorps dirigés contre les étiquettes HA ou flag (Figure 33). Cette observation confirme l’existence de modifications post traductionnelles sur la protéine Api5 (phosphorylation, acétylation, clivage ?).
De façon surprenante, l’isoforme de 469aa (issue d’un épissage alternatif de la pleine taille de 504 aa) est létale pour les cellules. Ils nous a été impossible de l’utiliser en expression transitoire avec les vecteurs « taptag » ou pEGFP C1 ; ni même en expression inductible, associée à un système d’expression tetON (les fuites du promoteur suffisaient à tuer les cellules transduites stablement avec le vecteur portant la construction « tetON Api5.469 »). Cette isoforme particulière de 469aa possède tous les domaines d’Api5 pleine taille, excepté le domaine leucine zipper qui a est tronqué. Cette isoforme semble constituer un dominant négatif létal de la protéine Api5.
Figure 33. Analyse par Western blot des isoformes 504/ 469/ 275/ 510/ 352/ 524/ 398/ 278aa d’Api5. Les différentes isoformes isolées ont été clonées dans un vecteur « taptag » qui porte en tandem deux étiquettes HA et deux étiquettes flag, en fusion avec l’ADNc d’intérêt. (A) Révélation avec un anticorps anti HA. (B) Révélation avec un anticorps anti flag. L’échelle est donnée en KDa.
A.
B.
Figure 34. Localisation cellulaire des isoformes d’Api5. (A/B) Des cellules HeLa ont été transfectées avec les isoformes de 504/ 510/ 524/ 398/ 352/ 278aa en fusion avec l’EGFP (en vert). Le vecteur EGFP vide a été utilisé comme contrôle. Les noyaux ont été colorés avec de l’IP (en bleu) (A) Détail de l’association à la chromatine des isoformes de 504 et 510 aa. Echelle 10µm.
EGFP Api5.524
Api5.398 Api5.352
Figure 35. Association à la chromatine des isoformes d’Api5. Les isoformes d’Api5 de 504 / 510 / 524 / 398 /352 / 278 aa (A à F) ont été clonées dans un vecteur en fusion avec l’étiquette HA et utilisées pour la transfection de cellules H1299. Les protéines associées à la chromatine ont été extraites par des traitements croissants en concentrations de NaCl, à partir de noyaux entiers. La présence de (HA)Api5, de la TBP (« TATA Box Binding Protein ») et de l’histone H3 a été analysée dans les différentes fractions par Western blot. (cyto = faction cytoplasmique ; 0 = fraction DNase ; 0,4 0,8 1 2M de NaCl ; N.E. = non extrait).
L’étude de la localisation des 11 isoformes d’Api5 identifiées, ainsi que l’étude de leur association à la chromatine a constitué le projet de stage de Master1 de l’étudiant Guillaume Perez, que j’ai encadré.
Les résultats de l’analyse de l’association à la chromatine du couple Api5/hmwFGF2, en fonction de l’isoforme d’Api5 surexprimée dans les cellules H1299, sont présentés dans la
Figure 35. L’analyse du comportement biochimique des différentes isoformes vis à vis de la
chromatine consiste à soumettre les culots nucléaires des cellules transfectées à des concentrations croissantes de NaCl pour permettre l’élution de protéines associées à la chromatine.
Les profils des Western blots des prototypes de grande taille, de 504, 510 et 524aa, sont identiques (Figure 35 A, B et C). La seule différence entre ces espèces pleine taille d’Api5 se situe dans leur dernier exon (exon 13, Figure 31) qui, dans les trois cas, ne semble pas coder pour des domaines protéiques conservés. La structure protéique de ces trois isoformes peut être considérée équivalente. Ces isoformes apparaissent représentées dans le cytoplasme, ceci peut s’expliquer par leur synthèse de novo dans le cytoplasme et/ou une contamination des protéines nucléaires dans le cytoplasme lors de l’extraction (cette dernière hypothèse est appuyée par la présence de la TBP dans le cytosol). Le profil d’association à la chromatine d’Api5 et les hmwFGF2 reste le même pour ces trois isoformes, à savoir une présence dans toutes les fractions nucléaires.
L’isoforme de 398aa, qui ne possède pas le premier domaine de liaison aux hmwFGF2, se retrouve dans toutes les fractions de l’extraction (Figure 35 D). Par contre, quand l’isoforme de 398aa est surexprimée, les hmwFGF2 sont sous représentées dans les fractions associées à la chromatine. Ce résultat fait penser à une nécessité de l’interaction Api5/hmwFGF2 pour que les hmwFGF2 soient associées à l’ADN.
L’isoforme de 352aa est un variant ayant perdu le premier domaine de liaison aux hmwFGF2. Comme l’isoforme de 398aa, elle est aussi retrouvée dans les fractions de haute concentration en NaCl, c’est à dire associée à la chromatine (Figure 35 E). Dans les conditions de surexpression de l’isoforme de 352aa, les FGF2 nucléaires sont largement sous représentés tandis qu’ont voit apparaître une forme clivée du FGF2 nucléaire. Cette forme de petit poids moléculaire, ainsi que le FGF2 de 18kDa, sont très fortement associés à la chromatine.
La dernière isoforme testée dans cette analyse est celle de 278aa. Elle a la particularité d’avoir perdu par épissage alternatif le deuxième domaine de liaison aux FGF2, le domaine
Leucine Zipper et la NLS. Elle se retrouve uniquement dans la fraction cytoplasmique et pas du tout associée à la chromatine (Figure 35 D), et ce malgré au marquage diffus observé pour cette isoforme de 278aa en immunofluorescence (Figure 34 B). De façon intéressante, les hmwFGF2 sont sous représentés dans le noyau lors de la surexpression de cette isoforme.