Rectification du courant ionique

dias

Os resultados deste ensaio foram ao encontro dos resultados obtidos por Poltera e colaboradores (1981), que comprovaram ineficácia farmacológica do BNZ na TA experimental em modelo murino. No trabalho anteriormente citado, o BNZ tinha apenas causado um aumento da circulação de imunocomplexos, não tendo diminuído a parasitémia nem causado redistribuição dos parasitas dentro do SNC. No presente trabalho foi comprovado que mesmo nas doses recomendadas e com tratamento precoce não se verificou o controlo da parasitémia nem um aumento da sobrevivência dos animais.

A parasitémia oscilante verificada no ensaio é uma característica típica tanto na infeção natural como na experimental (Taylor & Authié, 2004).

O ganho de peso no grupo tratado teve forte correlação (R=0.89) existindo uma relação linear entre o peso e o tempo de infeção, assim como poucos fatores fizessem variar o peso para além da relação entre as duas variáveis. A análise de regressão provou a existência de uma tendência forte para o ganho de peso no grupo tratado.

A mesma situação não se verificou no grupo controlo, considerando que a correlação foi fraca entre as duas variáveis (R=0.29), o que indica que a interação entre o tempo de infeção e o peso é pouco linear. Este fenómeno pode ser explicado pela interferência de outras variáveis na relação entre peso e tempo de infeção. O intervalo do GMD inclui números inferiores a 0, sugerindo que em certos animais do grupo controlo houve inclusivamente perda de peso.

Os resultados acima citados pareciam indicar uma melhoria clínica do uso do BNZ, visto que os animais tratados tinham um maior aumento de peso por dia que os controlos. Contudo, após análise estatística, onde as diferenças entre os dois grupos foram estatisticamente significativas, o emparelhamento entre dias nos dois grupos não foi eficaz, ou seja, o teste não ganhou poder em comparar os dois grupos por dia, ao invés de comparar os grupos como um todo. Assim, podemos concluir que os dois grupos foram no geral diferentes em termos de peso médio, mas não é possível tirar conclusões face a dias específicos.

Outros fatores que possam ter contribuído para as diferenças de peso e variação de peso, para além do tratamento, são exemplos a idade média do grupo, a ordem hierárquica dos animais na caixa, as alterações fisiopatológicas da doença, nomeadamente o edema e a organomegália, parasitismo gastrointestinal ou erro de medição.

A idade média do grupo é um fator importante na cinética do ganho de peso pois numa fase mais precoce do crescimento do animal existe uma maior tendência para o ganho de peso por crescimento do sistema músculo-esquelético de que em fases mais tardias por

85 deposição de gordura. Este fator não foi considerado como muito importante, pois as diferenças de idades máximas entre os animais antes da seleção eram 3 semanas, e estes foram distribuídos pelos dois grupos aleatoriamente.

A ordem hierárquica na caixa pensa-se ter sido importante neste ensaio, pois aumenta a variância entre animais do mesmo grupo. Os animais mais pesados e mais fortes assumem dominância e acesso preferencial ao alimento, ao esconderijo, e quando se verifica canibalismo são os primeiros a ingerir a carcaça, quase sempre um animal mais pequeno. Assim, um grupo mais homogéneo quanto ao peso e tamanho dos animais, como o grupo tratado, vai ser menos influenciado pela hierarquia da colónia que um grupo mais heterogéneo, como o grupo controlo.

A organomegália e o edema próprios da TA podem ter contribuído para aumento do peso nos animais doentes. Contudo, tendo em conta que não foram verificadas diferenças significativas entre ambos os grupo nem para a parasitémia nem para a sobrevivência, esta alteração patológica possivelmente não teve influência nas diferenças entre o grupo tratado e o grupo controlo.

O parasitismo gastrointestinal influencia negativamente o GMD, por espoliação de ingesta e má absorção gastrointestinal. Este fator foi controlado com análise coprológica prévia a uma amostra dos animais usados no ensaio. O resultado desta foi negativo, e o ambiente controlado, não sendo considerado o parasitismo provável.

Os erros de medição são importantes neste ensaio considerando o baixo peso dos animais utilizados. A sensibilidade da balança (1g) ser 4% do peso médio dos animais tornando qualquer erro acima de 1g é significativo (>5%). Infelizmente, por indisponibilidade de equipamento não foi possível realizar medições mais precisas. Na tentativa de diminuir o erro a balança era calibrada a cada 3 medições e os animais pesados dentro de recipientes que possibilitavam sua contenção. Porém, assumindo erro semelhante para ambos os grupos a influência deste fator não justifica por si as diferenças significativas entre os dois grupos.

Estes resultados não foram contudo conclusivos, dada a curta duração da terapêutica, a suscetibilidade da estirpe BALB-C à infeção e os dados de ganho de peso no grupo tratado, quando comparado com o grupo controlo. Com base nestas observações a necessidade de repetição da experiência com uma estirpe de animais menos suscetíveis à progressão da doença e com uma maior duração da terapêutica.

Outro argumento para a repetição da experiência foi o facto da dose estabelecida ser uma dose média, o que pode ter motivado sobredosagem em animais mais pequenos e subdosagem nos maiores, principalmente com um tão curto período de terapêutica.

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5.3. Ensaio de determinação da eficácia do benznidazol na infeção

intraperitoneal por T. b. brucei num protocolo terapêutico de 11

dias

Este ensaio surgiu como uma confirmação do anterior com um modelo animal menos suscetível à progressão da doença, com uma duração da terapêutica maior e com uma dose calculada com o objetivo de evitar subdosagens.

Confirmou-se que as diferenças nos valores de parasitémia e na sobrevivência não foram estatisticamente significativas, mesmo tendo a indicação que os animais controlo tiveram um risco de morrer 59% maior que os animais tratados. As variações da parasitémia foram consistentes com o que está descrito na literatura (Taylor & Authié, 2004).

Quanto ao peso, nesta experiência confirmaram-se diferenças significativas entre os dois grupos de animais com emparelhamento eficaz, mesmo não havendo no geral ganho de peso, sendo que os tratados tiveram menor tendência para a perda de peso que os controlos. A correlação ente as duas variáveis em ambos os grupos foi baixa, sendo mais baixa no grupo tratado. Esta baixa correlação pode estar relacionada com o facto da variação do peso ser pouco linear, havendo um período de claro ganho de peso até ao 14º DPI sendo depois notória a tendência para a perda de peso. Assim, é notório um efeito do BNZ na variação do peso, embora seja necessário que este efeito seja explorado em detalhe, visto que nas outras variáveis clínicas não se verificaram diferenças significativas. Quanto aos resultados de hematologia, no que se refere ao eritrograma, a anemia verificada foi consistente com os dados descritos na literatura (Taylor & Authié, 2004; Pentreath & Kennedy, 2004), excepto no que concerne aos índices eritrocitários dos animais tratados na fase mais tardia. A tendência estatísticamente significativa para a macrocitose com hipocromia pode revelar ação do BNZ a nível da medula, ação essa que já foi descrita para outras linhas celulares (Rassi & Luquetti, 2004). Para determinar se esta ação é inibitória ou estimuladora poderia ter sido realizada uma contagem manual de reticulócitos ou um mielograma para analisar as proporções dos diferentes núcleos hematopoiéticos. No entanto tal não foi exequível no decorrer deste trabalho por limitações de tempo para análise e interpretação dos esfregaços e por não ter sido incluído o estudo da medula óssea no plano experimental, não tendo sido realizada a colheita deste tecido.

Quanto ao leucograma os resultados foram discordantes dos reportados na literatura, porque não foi evidenciada a tendência para a pancitopenia característica da infeção por T. b. brucei, observando-se uma tendência para a leucocitose com neutrofilia no grupo controlo. A neutropenia verificada no grupo tratado foi consistente tanto com a fisiopatologia da doença como com as reações adversas do BNZ reportadas por Rassi e Luquetti (2004) e Taylor e Authié (2004). As diferenças para todas as linhagens celulares não foram

87 estatisticamente significativas, possivelmente devido ao baixo número de amostras e ao elevado desvio-padrão verificado. De realçar também que a calibração do aparelho para as células humanas poderá ter influenciado a contagem diferencial automática. As causas de leucocitose podem ser variadas, podendo ter como origem infeção bacteriana secundária, devido à imunossupressão causada pela TA (Taylor & Authié, 2004; Baral, 2010; De Sousa et al.; 2011).

Quanto ao trombograma os resultados foram semelhantes aos reportados por vários autores (Taylor & Authié, 2004; Pentreath & Kennedy, 2004).

As titulações de IgG e IgM anti-T. b. brucei mostaram-se de acordo com a literatura, verificando-se aumento dos títulos com o aumento do tempo de infeção, sendo que os títulos de IgM se apresentam mais variáveis que os títulos de IgG (Taylor & Authié, 2004). Quanto às subclasses de IgG, o perfil de IgG2a e a IgG3 dominantes é verificado nas infeções naturais e experimentais por T. b. brucei, e denota uma resposta maioritáriamente Th1, com altas concentrações de IFN-γ, que é esperada na TA (Baudino et al., 2006; De Sousa et al., 2011). As diferenças estatisticamente significativas no grupo tratado, com títulos mais elevados de IgG1, IgG2a e IgG3 indicam uma alteração na imunomodulação nestes grupos, com um mais pronunciado padrão Th1, contudo com pouca inibição da produção de IgG1, própria de uma resposta Th2 (Baudino et al., 2006).

A apreciação da polarização da resposta imunitária usando o rácio Th1/Th2 demonstrou não existirem diferenças estatisticamente representativas entre os dois grupos quanto à intensidade da resposta. Contudo é importante salientar alguns aspetos desta avaliação de resposta.

O primeiro aspeto é a resposta imunitária em animais saudáveis ter sido Th1. Este resultado deve-se à elevada reatividade do anticorpo secundário anti-IgG2a, relativamente ao anticorpo secundário IgG1, elevando o rácio basal de 1 para 1,8. O segundo aspeto que é importante salientar é que o rácio calculado é qualitativo e não quantitativo. Um rácio quantitativo proporciona uma informação mais correta relativamente à polarização da resposta, visto que é calculado com concentrações de marcadores e não com as absorvências destes. O último aspeto a referir poderá ser o facto de o rácio ter sido calculado com apenas dois marcadores de cada resposta. Selecionando outros pares de marcadores poderia levar à obtenção de resultados diferentes. A restrição da análise a pares não permite uma avaliação global da resposta imunitária.

Para justificar estes resultados a quantificação de citocinas veio fornecer dados importantes nomeadamente no que concerne ao IFN-γ. Os pontos inquantificáveis nos ELISA de quantificação de IL-4 e IFN-γ podem ter sido devidos a baixa sensibilidade da técnica, não sendo distintos os pontos de baixa concentração com o branco da curva de calibração; problemas no bloqueio da placa que permitiram adsorção do anticorpo secundário com a

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placa; tempo de incubação insuficiente para a temperatura ambiente; ou maior afinidade da citocina recombinante do padrão com os anticorpos de deteção e captura que a citocina natural. Infelizmente, dado os problemas da técnica agora referidos, a quantificação exata não foi conclusiva para IL-4 e IFN-γ, tendo sido utilizados os valores de absorvência para a realização de análise estatística. Esta revelou, que embora as concentrações médias aparentes de IL-4 se tivessem mantido relativamente inalteradas no grupo tratado, as diferenças entre os dois grupos não foram estatisticamente significativas.

Quanto ao IFN-γ, a concentração significativamente maior no 14º DPI nos animais tratados foi atribuída como a principal responsável pelo aumento dos títulos de IgG2a e IgG3 anti-T. b. brucei. Esta estimulação de IFN-γ induzida pelo BNZ está reportada por vários autores, bem como a manutenção da expressão de certas citocinas Th2 como IL-10 e IL-4 (Olivieri, et al., 2002; Sathler-Avelar, et al., 2006; Maya et al., 2007).

A concentração de TGF-β1 tendeu a diminuir igualmente em ambos os grupos. Está reportada a inibição desta citocina na fase crónica da infeção por T. b. brucei, e a diminuição das suas concentrações, especialmente no SNC, é correlacionada com aumento da mortalidade (Masocha et al., 2008; MacLean, et al., 2012).

A concentração de NO tendeu a manter-se sensivelmente inalterada no grupo tratado, aparentando um aumento discreto no grupo controlo. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas e vêm corroborar o que Maya et al. (2007) defenderam, isto é, que o stress oxidativo por formação de compostos reativos de azoto, como o NO não é o principal mecanismo de ação do BNZ, pois se assim fosse, as concentrações de NO estariam aumentadas no grupo tratado.

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