Nous avons montré deux stratégies pour mimer un canal biologique grâce à la fonctionnalisation de la surface d’un nanopore, une première irréversible et la deuxième réversible. Dans les deux cas nous avons préparé des pores en polymère (PET) par la technique de la trace latente. Nous avons pu fabriquer des pores symétriques ou asymétriques grâce à l’attaque chimique. Ce procédé d’irradiation par ions lourds et d’attaque chimique crée des fonctions chimiques (-COOH) sur la surface interne du pore. Nous avons
Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant
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donc utilisés ces groupes pour effectuer des liaisons chimiques ou électrostatiques avec différentes molécules, ou biomolécules. Nous avons utilisé des méthodes où chaque étape peut être caractérisée. Dans le cas de la première fonctionnalisation irréversible, nous avons utilisé le complexe avidine biotine, pour mimer un canal biologique, pH-répondant, et ligand-détection. L’objectif est donc l’intégration d’élément de bio-reconnaissance pour concevoir un biocapteur fonctionnel, grâce aux modulations de la réponse I-V. La préparation d’un nanopore unique dans un film polymère avec une fonctionnalisation asymétrique a ainsi été montrée. Nous avons utilisé deux approches différentes pour fonctionnaliser un nanopore, tout d’abord une fonctionnalisation directe de la surface interne du pore, et une deuxième après dépôt de couche atomique permettant une fonctionnalisation homogène de toute la surface du pore (interne et externe). Nous avons tout d’abord modifié le pore directement sur les fonctions –COOH, par greffage successif de biotine (avec des chaines plus ou moins longues), et d’avidine, par une méthode monotope. Chaque étape de la fonctionnalisation a pu être suivie puisqu’elles induisent des modifications de la courbe IV. Celle-ci a l’avantage d’être très facile et rapide, mais nous avons pu constater que nous observions des oscillations dues à des problèmes d’adsorption non spécifique. Pour résoudre ce problème, nous avons donc eu recourt à une fonctionnalisation interne et externe du nanopore, qui empêche l’adsorption non-spécifique. Nous avons ensuite pu suivre chaque étape de la fonctionnalisation. Comme pour la fonctionnalisation monotope, le greffage asymétrique provoque une rectification de courant. Celle-ci dépend des charges à la fois des protéines et des groupements amines libres à l’intérieur du pore. Nous avons également étudié l’importance de longueur de la chaine greffée. Nos résultats montrent la possibilité de différencier l’avidine de la streptavidine. La partie la plus intéressante est probablement la fermeture réversible pour des pHs inférieurs à 6, liées aux modifications des couches de PEG et de leurs agrégations avec des protéines. Un autre intérêt de cette technique est qu’elle permet de détecter des protéines biotinylées, ainsi que des anticorps. Enfin cette stratégie est intéressante car de faibles concentrations en protéines sont nécessaires pour leurs détection (environ 1 nM), et ne nécessite pas de marqueurs, fluorescent par exemple. Toutefois le principal problème de la fonctionnalisation chimique est son irréversibilité. Le nanopore est à usage unique, après capture et détection des protéines, il est impossible de le réutiliser. C’est pour cela que nous avons étudié une seconde stratégie pour obtenir une fonctionnalisation réversible de l’intérieur du pore.
Dans le but de concevoir un pore avec des propriétés réversibles, nous avons utilisé des poly-électrolytes. Ainsi en utilisant cette seconde stratégie de fonctionnalisation réversible, notre but était de concevoir un nanopore biomolécule-répondant qui après utilisation peut retrouver sa surface d’origine, sans endommager le nanopore. Pour ce faire, nous avons utilisé une fonctionnalisation basée sur un auto-assemblage couche par couche de PLL et de PSS.
Nous avons démontré que la fonctionnalisation par polyélectrolyte est adaptée pour la modification d’un nanopore. En effet cette fonctionnalisation présente plusieurs avantages, elle:
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- 100 - - a lieu en moins d’une minute,
- peut être suivie en temps réel,
- est totalement réversible à pH 12, et n’endommage pas le nanopore
Nous avons également montré que les PLL et les bicouches PLL/PSS sont appropriées pour moduler la sélectivité ionique d’un nanopore conique. De plus, la fonctionnalisation par PLL-g-mPEG-biotines peut être utilisée pour concevoir un capteur où le nanopore serait réutilisable. Ceci peut être considéré comme un progrès réel comparé aux fonctionnalisations classiques sur les nanopores fabriqués par la technique de la trace latente. Cependant quelques problèmes restent à résoudre. Si le pore est trop petit, l’adsorption des poly-électrolytes n’est pas possible, il faut donc utiliser un diamètre optimisé. Après l’adsorption successive des poly-électrolytes, nous ne pouvons pas déterminer précisément la taille du diamètre. Nous ne pouvons pas prédire exactement la manière dont ils s’arrangent, les phénomènes de gonflement, sur quelle longueur ils se sont adsorbés. L’avantage des pores fabriqués par la technique de la trace latente, est leur facilité à transposer cette méthode à une membrane multipore. Ainsi, il est donc possible d’étendre ce processus dans le but de concevoir des membranes possédant de larges surfaces pour des applications de séparation ionique ou de capteurs.
Chapitre 4. Détection de molécule unique : Influence de la surface du pore - 102 -
Chapitre 4.
Détection de molécule
unique : Influence de la
surface du pore
Dans cette partie nous nous sommes intéressés à l’amélioration de la résolution des nanopores en modifiant leurs interactions électrostatiques avec la macromolécule grâce à des modifications de leurs surfaces et de leurs charges. Nous avons tenté de comprendre d’un point de vue fondamental le passage des macromolécules à travers ces nanopores modifiés.
Les résultats présentés dans ce chapitre ont fait l’objet de deux publications et d’un « proceeding » (Annexe 2) :
- Lepoitevin, M., P. E. Coulon, et al. (2015). "Influence of nanopore surface charge and magnesium ion on polyadenosine translocation." Nanotechnology 26(14) : 144001-144010.
- M. Lepoitevin, M. Bechelany, et al. (2015). "Influence of nanopore surface charge on polycytosine translocation." Physics, Chemistry and Applications of Nanostructures: 457-461
doi: 10.1142/9789814696524_0113
- Thangaraj, V., M. Lepoitevin, et al. (2016). "Detection of short ssDNA and dsDNA by current-voltage measurements using conical nanopores coated with Al2O3 by atomic layer deposition." Microchimica Acta 183(3): 1011-1017.
Chapitre 4. Détection de molécule unique : Influence de la surface du pore
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