Fonctionnalisation par avidine ou streptavidine

Dans le but d’étudier la détection de protéines capturées nous avons utilisé les propriétés d’interaction de la biotine avec l’avidine ou la streptavidine. Tout d’abord, nous nous sommes intéressés à l’effet de l’addition d’avidine (ou de streptavidine) sur les réponses I-V à différents pHs.

Une solution de streptavidine (ou d’avidine) est ajoutée du côté cis. Dans le cas présent les parois externes et internes (au moins à l’entrée) du nanopore sont recouvertes de PEG-biotine ou -biotines, rendant ainsi peu probable une adsorption non-spécifique de la protéine à l’entrée du pore. Après cette étape les courbes I-V sont enregistrées à 100 mM NaCl, en faisant varier le pH de 4 à 10. Tout d’abord il est important de noter que l’on n’observe pas de perturbations lorsque l’on enregistre le courant en fonction du temps quelque soit le voltage appliqué. Ceci confirme notre interprétation concernant la première approche et l’adsorption non-spécifique des protéines.

Figure 41: Courbes I-V, après le greffage des chaines terminées par des biotines (carrés ouverts), et après

greffage des protéines (carrés pleins). a. Noir : NP26PEGBiot pore de 26 nm de diamètre avec des chaines

-PEG-biotine et de l’avidine. b. Rouge : NP22PEGBiot pore de 22 nm de diamètre avec des chaines

-PEG-biotine et de la streptavidine. c. Vert : NP18Biot pore de 18 nm de diamètre avec des chaines -biotine et de

a

b

c

Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant

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l’avidine. d. Bleu : NP22Biot pore de 24 nm de diamètre avec des chaines -biotine et des streptavidines. Toutes

les expériences sont effectuées à 100 mM de NaCl.

Les réponses I-V montrent une diminution du courant après avoir inséré les protéines sur à la fois les – PEG-biotine ou les –biotines. Ceci prouve que l’attache des protéines à bien eu lieu. Le facteur de rectification du courant (Rf) est défini en chapitre 1 (éq 1.18).

Pour les longues chaines (-PEG –biotines) le facteur de rectification est inférieur à 1, avant et après l’insertion d’avidine (ou streptavidine), et est indépendant du pH entre 6 et 10. Ceci semble montrer que la charge de la protéine n’a pas d’influence sur le courant de rectification. Dans le cas des –biotines, la charge influence le facteur de rectification. En effet après la capture des protéines, Rf est pour les différents pHs, supérieur à 1 pour la streptavidine et inférieur à 1 pour l’avidine. Le facteur de rectification, pour à la fois l’avidine et la streptavidine, tend vers 1 pour un pH supérieur à 9. Si l’on regarde de plus près nos conditions expérimentales, seulement l’entrée du nanopore a été fonctionnalisée avec des –biotines. Après la capture des protéines, la charge du nanopore est différente à son entrée (liée aux protéines) de la paroi interne (groupements amines). Donc le courant de rectification dépendrait de la charge des protéines mais aussi des groupements amines (pKa ≈ 10,6), pour des pH supérieurs à 9.

Figure 42: Facteur de rectification en fonction du pH. Noir : NP26PEGBiot pore de 26 nm de diamètre avec

des chaines -PEG-biotine et de l’avidine. Rouge : NP22PEGBiot pore de 22 nm de diamètre avec des chaines

-PEG-biotine et de la streptavidine. Vert : NP18Biot pore de 18 nm de diamètre avec des chaines -biotine et

de l’avidine. Bleu : NP22Biot pore de 24 nm de diamètre avec des chaines -biotine et des streptavidines. Toutes

5 6 7 8 9 10

0,1

1

10

F

acteur

de r

ectification

pH

Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant

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les expériences sont effectuées à 100 mM de NaCl. Les résultats à des pHs inferieurs à 6 ne sont pas montrés

pour les longues chaines comme il a été montré qu’il y a un phénomène d’agrégation210

A ce stade, nos résultats montrent qu’il est possible de discriminer la capture de l’avidine de celle de la streptavidine en utilisant une liaison courte, car le courant dépend de la charge de la protéine.

1.2.2. Pore pH-dépendant et importance de la longueur de la chaine greffée

Dans cette partie nous nous sommes intéressés à l’influence du pH sur les propriétés de rectification du courant et de conductivité du nanopore NP22PEGBiot après greffage de streptavidine.

Cette dernière a un point isoélectrique proche de 5, et donc pour un pH supérieur à 6, possède une charge globale négative.

Figure 43: Exemple de courbes I-V (ici à 100 mM NaCl) d’un nanopore après le greffage de PEG-Biotine-Streptavidine à différents pHs. pH 10 (noir), pH 9 (jaune), pH 8 (vert), pH 7 (bleu), pH 6 (cyan), pH 5 (olive), pH 4 (rouge).

L’étude des réponses I-V en fonction du pH montre que pour des pHs supérieurs à 5, il y a une légère rectification du courant comme pour les nanopores coniques, ceci est due à la fonctionnalisation asymétrique du nanopore.(Figure 43) La localisation des protéines du coté cis, induit donc une différence de charge sur la paroi interne du nanopore. Ceci entraine un flux d’ions asymétriques.227 Quand un potentiel négatif est appliqué du coté trans, la streptavidine est repoussée hors du nanopore, et

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

-200

-100

0

100

C

our

ant

(

pA

)

Voltage (V)

Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant

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inversement quand un potentiel positif est appliqué. De plus, cette rectification de courant peut être expliquée par la localisation des streptavidines (à l’intérieur ou à l’extérieur du pore, en fonction du potentiel appliqué et de la charge globale de la protéine) ce qui peut réduire le diamètre du pore du coté cis. Il est intéressant de noter qu’à des pHs inferieurs à 6 le courant diminue drastiquement. A pH 4, quelque soit le voltage appliqué, le courant enregistré est proche de zéro. Nos expériences montrent que cette fermeture est parfaitement réversible puisque, dès lors que l’on augmente le pH, le pore se rouvre, et les valeurs de courant sont retrouvées.

Figure 44: Réponse en pH d’un nanopore modifié par ALD, après le greffage de PEG-Biotine-Streptavidine. Courbe I-V pour un gradient de pH (pH 4 du coté cis et pH 8 du coté trans)

Afin de confirmer la réversibilité, un gradient de pH est appliqué (pH 4 du coté cis et pH 8 du coté trans), le courant est proche de zéro pour un potentiel inférieur à 400 mV, et augmente au-delà (Figure 44). Ceci confirme donc bien la dépendance au pH, et la réversibilité de cette ouverture/fermeture. Cette fermeture à pH inférieur à 6 ne peut pas être due à un effet stérique de la protéine. En effet, si tel était le cas, une inversion de la rectification du courant devrait être observée en fonction de la charge globale de la protéine.

Donc cette fermeture du pore serait due aux chaines PEG. Pour le vérifier, un nanopore semblable à NP22PEGBiot a été fonctionnalisé avec une chaine biotinylée plus courte (biotine-NHS) avant l’insertion de la streptavidine (NP22Biot). Les courbes I-V ne présentent pas de blocage du courant à pH 4, (Figure

Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant

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45) ce qui tend à prouver que la fermeture du pore est bien liée à l’interaction entre les longues chaines PEG et la streptavidine(Figure 45).

Figure 45: Exemple de courbes I-V (ici à 100 mM NaCl) d’un nanopore (d = 26 nm) après le greffage de Biotine-Streptavidine à différents pHs : pH 10 (noir), pH 9 (jaune), pH 8 (vert), pH 7 (bleu), pH 6 (cyan), pH 5 (olive), pH 4 (rouge)

Il a été démontré que le pH joue un rôle important dans les interactions PEG/protéines. En effet à faible pH des phénomènes d’agrégation et de précipitations des protéines avec les PEG sont observés.228,229 Le pH joue également un rôle dans le gonflement de couches de PEG. 230,231 Cependant lorsque le nanopore est fonctionnalisé seulement avec les PEG-biotine, le phénomène de fermeture n’est pas observé à bas pH. Donc, la fermeture du pore est bien liée aux interactions PEG-protéines, probablement une agrégation réversible. Ainsi dans le cas du gradient de pH, quand un potentiel négatif est appliqué, les protons entrent préférentiellement le nanopore et créent l’agrégation des PEG-biotine-streptavidine, provoquant la fermeture du pore. Inversement, quand un potentiel positif est appliqué, les ions hydroxydes pénètrent le pore et provoquent la désagrégation des PEG-biotine –streptavidine et la réouverture du pore. (Figure 46)

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

-100

0

100

Cour

ant (

pA

)

Voltage (V)

Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant

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Figure 46 : Schéma représentant l’agrégation/désagrégation des protéines sous l’influence du pH