3. Principes de la détection de molécule à l’échelle unique
La détection de molécules unique par la technologie nanopore se développe pour de nombreuses applications de biocapteur, (protéines, ADN) ou détection de nanoparticules.11,116,117 Cette méthode est préférable à celles à grandes échelles, types membranes, lorsque les échantillons à analyser sont en quantité limité ou quand un ensemble de mesure pourrait masquer l’hétérogénéité de l’échantillon. Les nanopores ont tout d’abord été utilisés comme des compteurs Coulter.118 Le compteur Coulter est utilisé en routine pour le comptage des cellules sanguines par exemple. Le principe de ce compteur est de conduire un analyte à travers un pore de dimensions semblables, qui connecte deux demi-cellules contenant la même solution électrolytique. Quand l’analyte (objet) passe d’une chambre à l’autre, à travers le pore, la résistance du pore change, et il peut être détecté par une modification du courant ionique : un blocage si l’objet diminue le nombre de charges mobiles à l’intérieur du pore ou, si il apporte une densité de charge plus importante que celle de la solution, une augmentation de courant.
Figure 11 : Schéma représentant un blocage et une augmentation en fonction du temps
Trois paramètres sont utilisés pour caractériser chacune de ces perturbations : le temps de résidence dans le pore δt, l’amplitude de la perturbation |ΔI| et le taux de capture f. Ce dernier est le nombre d’événement par seconde. Ces paramètres dépendent à la fois des propriétés de l’objet traversant le pore (taille, charge, forme, déformabilité) mais aussi du pore (diamètre, charge et état de surface, rapport d’aspect).
Il est possible de prédire les perturbations de courant en utilisant différents modèles. Pour le passage d’ADN dans des nanopores de faible rapport d’aspect, il a été montré que le courant augmente ou diminue en fonction de la concentration en sel.119 En effet, dans un nanopore de 4 nm de diamètre, à 0,1 M KCl, une augmentation de courant est observée lors du passage de l’ADN, ce qui a été expliquée par le courant de surface à l’intérieur du pore. L’augmentation de courant a été attribuée à l’introduction de contre-ions dans le pore due à la charge de l’ADN. Ceci a été confirmé par l’équipe de Dekker.120 Ils ont étudié le passage de l’ADN à travers un nanopore en SiN de 12 nm de diamètre. Ils ont estimé que deux effets compétitifs sont à prendre en compte. D’une part, la conductance diminue du fait du volume occupé par la molécule d’ADN, ce qui diminue le nombre de porteurs de charges pour le transport
temps
blocage
Co
ur
an
t
Co
ur
an
t
augmentation
Chapitre 1 : Etude bibliographique
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ionique. D’autre part, les contre-ions qui masquent la charge de l’ADN ajoutent une contribution positive au courant. En prenant ces deux effets en compte, le changement de conductance (G) due au passage de l’ADN peut être décrite par l’équation 1.19120 :
∆𝐺𝐺 =𝑛𝑛𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷
𝑑𝑑 �−𝜋𝜋4𝑑𝑑𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷2 (𝜇𝜇++ 𝜇𝜇−)𝑅𝑅𝐾𝐾𝐾𝐾𝑠𝑠𝑒𝑒 + 𝜇𝜇+∗𝑞𝑞𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷∗ � (éq 1.19) où nDNA est le nombre de molécule d’ADN dans le pore, dDNA est le diamètre du brin d’ADN, μ*
est la mobilité électrophorétique effective des ions potassium se déplaçant le long du brin d’ADN, et q* est la charge effective de l’ADN par unité de longueur, qui est supposé constante.
A partir de cette équation, il a été montré que le passage de l’ADN peut induire soit une augmentation (basse force ionique, [KCl] < 0,4 M) ou une diminution (forte force ionique, [KCl] > 0,4 M) de courant. Ces dernières seraient engendrées par le blocage partiel du pore et les augmentations sont attribuées au mouvement des contre-ions qui cache la charge de l’ADN.
Dans le cas des protéines traversant un nanopore de faible rapport d’aspect, les blocages de courant vont dépendre de leur volume hydrodynamique et de leur facteur de forme. Ils peuvent être prédits par une dérivation de l’équation de Maxwell :48,49
Δ𝐼𝐼
𝐼𝐼0 =𝜋𝜋𝑑𝑑 4𝛾𝛾Λ
𝑝𝑝2�𝑠𝑠𝑝𝑝+0.8𝑑𝑑𝑝𝑝�𝑆𝑆 𝑟𝑟𝑝𝑝
𝑑𝑑𝑀𝑀 (éq 1.20)
où Λ est le volume de la protéine (m3) qui est estimé grâce au coefficient de diffusion de la protéine obtenue par FCS, et γ est le facteur de forme. Celui-ci est de 1,5 pour les géométries sphériques. Dans le cas des prolates sphéroïdes ϒ peut prendre deux valeurs 𝛾𝛾∥ et 𝛾𝛾⊥ (éq 1.20) qui dépendent de
l’orientation de la protéine.
𝛾𝛾∥=1−𝑛𝑛1
∥ et 𝛾𝛾⊥=1−𝑛𝑛1
⊥ (éq 1.21)
où 𝑅𝑅∥ et 𝑅𝑅⊥ pour des prolates sphéroïdes avec 𝑚𝑚 = 𝑎𝑎 ∕ 𝑏𝑏 donné par (éq 1.21) 𝑅𝑅∥=𝑚𝑚21−1�√𝑚𝑚𝑚𝑚2−1ln�𝑚𝑚 + √𝑚𝑚2− 1� − 1� et 𝑅𝑅⊥=�1−𝑛𝑛∥�
2 (éq 1.22)
𝑆𝑆 𝑟𝑟𝑝𝑝
𝑑𝑑𝑀𝑀 est le facteur de correction donné par (éq 1.23)
𝑆𝑆 𝑟𝑟𝑝𝑝 𝑑𝑑𝑀𝑀= 1 1−0.8�𝑑𝑑𝑀𝑀 𝑑𝑑𝑝𝑝 � �3 (éq 1.23)
Dans le cas de sphères chargées toujours dans un nanopore de faible rapport d’aspect, l’intensité des blocages est dépendante du volume de la particule et de la géométrie du pore. La hauteur relative du courant est dans ce cas prédite par l’équation:121
Chapitre 1 : Etude bibliographique - 34 - 𝑅𝑅𝑝𝑝𝑎𝑎𝑟𝑟𝑝𝑝𝑖𝑖𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝−𝑅𝑅𝑣𝑣𝑖𝑖𝑣𝑣𝑝𝑝 𝑅𝑅𝑣𝑣𝑖𝑖𝑣𝑣𝑝𝑝 =𝐼𝐼𝑣𝑣𝑖𝑖𝑣𝑣𝑝𝑝−𝐼𝐼𝑝𝑝𝑎𝑎𝑟𝑟𝑝𝑝𝑖𝑖𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 𝐼𝐼𝑝𝑝𝑎𝑎𝑟𝑟𝑝𝑝𝑖𝑖𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝 =𝐷𝐷𝐿𝐿�𝑠𝑠𝑖𝑖𝑛𝑛−1�𝑣𝑣𝐷𝐷� �1−�𝑣𝑣 𝐷𝐷�2−𝑑𝑑𝐷𝐷� (éq 1.24)
où d est le diamètre de la particule, D est le diamètre du pore, L est la longueur du pore, Rparticule et Rvide
sont les résistances électriques avec et sans la particule, Iparticule et Ivide sont les courants équivalents.
- Si le temps de résidence est considéré comme dépendant uniquement du champ électrostatique.
𝛥𝛥𝑅𝑅 =6𝜋𝜋𝜂𝜂𝐿𝐿𝑞𝑞𝑞𝑞 (éq 1.25)
- Si la vitesse de passage des bio-molécules prend en compte les états de charge de l’objet et du pore.122 Elle dépendrait à la fois des potentiels zêta de l’objet (ζPx) et du nanopore (ζNP). 𝑣𝑣𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 =𝜀𝜀𝑞𝑞𝜂𝜂 (𝜁𝜁𝑃𝑃𝑃𝑃− 𝜁𝜁𝐷𝐷𝑃𝑃) (éq 1.26) où E est le champ électrique, ε est la permittivité diélectrique (ε = ε0 ; εr = 78) et η est la viscosité du fluide (10-3 Pa s).
La fréquence à laquelle la molécule entre dans le nanopore est désigné par le taux de capture et dépend des propriétés de l’objet (charge, taille,…), de la solution d’électrolyte (pH, concentration,…) et des dimensions du nanopore (diamètre et épaisseur du film), ainsi que du voltage appliqué à travers le pore.123 Si seulement la diffusion est prise en compte, le taux de capture serait de :
𝑓𝑓𝑑𝑑= 2𝜋𝜋𝑐𝑐𝑏𝑏𝐷𝐷𝑟𝑟𝑠𝑠 (éq 1.27)
Dans le cas de molécules chargées il faudrait prendre en compte le champ, qui n’est pas négligeable, proche du pore, dans ce cas le rayon de capture serait défini par :124
rC∗ = RC/(2πD0C0) (éq 1.28)
Ces modèles ne prennent pas en compte la barrière d’énergie que les objets doivent franchir pour entrer dans le pore. Dans ce cas, la dépendance entre le taux de capture et la barrière d’énergie d’entrée (U) suivrait une loi de Van’t Hoff Arrhénius.125
𝑓𝑓 = 𝜅𝜅𝜅𝜅𝐾𝐾𝜇𝜇𝑃𝑃𝑃𝑃(𝑏𝑏𝑝𝑝𝑝𝑝𝑏𝑏)𝐷𝐷𝐴𝐴
𝐿𝐿 . exp −𝑘𝑘𝑈𝑈
𝐵𝐵𝑇𝑇 (éq 1.29)
où κ est le facteur de probabilité, ν est le taux de fréquence, kB est la constante de Boltzmann, T est la température, A est l’aire en coupe transversale du nanopore, L est la longueur du nanopore, μPx(bulk) est la mobilité du polynucléotide, V est le voltage appliqué et C est la concentration en polynucléotide. La barrière d’énergie globale peut être décomposée en trois composantes :
𝑈𝑈 = 𝑈𝑈∗ + 𝑈𝑈𝑞𝑞𝐸𝐸− 𝑧𝑧𝑒𝑒|𝑉𝑉| (éq 1.30)
Le terme zeV est l’énergie apportée par l’électrode de travail sur l’objet, z est le nombre de charge apparente, et e est la charge élémentaire. U* est une composante entropique liée à la diminution des degrés de liberté et au changement de conformation de l’objet. UES est la composante électrostatique induite par la différence de charge entre la surface interne du pore et l’objet 126.
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