Détection de protéines biotinylées et d’anticorps

Ici, nous nous intéressons au potentiel du pore pour détecter une protéine biotinylée, en utilisant comme protéines modèles, la BSA et l’IgG. Pour ce faire, les protéines sont marquées avec un - PEG-biotine. 1 mL de protéines (1 mg mL⁻¹) dans du PBS (0,01 M phosphate buffer, 0,0027 M potassium chloride et 0,137 M sodium chloride, pH 7,4, à 25ºC) est ajouté à du Poly(ethylene glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) ether 2-(biotinylamino)ethane pour un ratio molaire de 1:1 et est ensuite incubé pendant 0,5 h à 20°C. Ensuite les - PEG-biotines n’ayant pas réagi sont séparés par centrifugation (16000 g, 1 min) en utilisant un filtre (Biospin P6). L’ajout de biotine-PEG-γglobuline et - biotine-PEG-BSA se fait du coté cis du pore.

Tout d’abord nous nous intéressons à l’ajout de biotine-PEG-γglobuline sur des pores -PEG-biotine-streptavidine, NP22PEGBiot et –biotine-streptavidine, NP24Biot. 100 μL de biotine-PEG- γglobuline (0,5 mg ml⁻¹) sont ajouté du coté cis de la cellule, dans 1,8 mL de NaCl (100 mM) et HEPES (1 mM) à pH 8, en appliquant un potentiel de 200 mV, pendant 1 h.

On observe une modification de la réponse I-V après ajout de biotine-PEG- γglobuline, ce qui prouve que le greffage a fonctionné. En ce qui concerne la position des protéines, elles peuvent se situer soit proches de l’entrée du pore, soit à l’entrée du pore, soit à l’intérieur du pore. Cependant la légère diminution de courant, et le volume stérique occupé par les PEG-streptavidine semblent suggérer que les protéines sont à l’extérieur du pore, proche de l’ouverture et il est très peu probable qu’elles soient à l’intérieur du pore. Mais ces résultats ne permettent pas de conclure quand à la position précise de la protéine.

Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant

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Figure 47: Exemple de courbes I-V (ici à 100 mM NaCl) d’un nanopore après le greffage de biotine-PEG-γ-globuline sur des PEG-Streptavidine à différents pHs : pH 10 (noir), pH 9 (jaune), pH 8 (vert), pH 7 (bleu), pH 6 (cyan), pH 5 (olive) et pH 4 (rouge)

Pour le pore avec les longues chaines, NP22PEGBiot, les courbes I-V à différents pH montrent :

- des rectifications de courant pour des pHs supérieurs à 6. L’amplitude de courant diminue légèrement du fait de la diminution du diamètre lié au greffage et la rectification est un peu plus prononcée.

- des blocages de courant pour des pHs inferieurs à 6 (Figure 47). Les propriétés d’ouverture/fermeture du pore ne sont pas modifiées par l’addition de biotine-PEG- γglobuline.

Pour illustrer ceci, le facteur de rectification en fonction du pH est reporté (Figure 48). Les résultats montrent que l’ajout de biotine-PEG- γglobuline (IEP 6,5) induit une augmentation du facteur de rectification. La protéine biotinylée peut ainsi être facilement détectée pour des pHs supérieurs à 6. Cependant la forme des courbes I-V reste inchangée, en effet, le facteur de rectification est toujours inferieurs à 1.

Pour les chaines courtes de biotines, l’insertion de biotine-PEG- γglobuline induit une diminution du facteur de rectification indépendamment du pH. Cette diminution est plus prononcée à pH 7 et 8 quand la streptavidine et la - γglobuline ont des charges globales opposées (globalement positive pour la streptavidine et globalement négative pour la - γglobuline). De pH 5 à 8 et en particulier pour les pH 7-8, l’inversion de la réponse I-V permet donc une détection plus facile des biotine-PEG- γglobuline.

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

-150

-100

-50

0

50

100

Cour

ant (

pA

)

Voltage (mV)

Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant

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Figure 48: Insertion biotine-PEG- γglobuline: gauche : courbes I-V à pH 7 et NaCl 100mM, après l’addition

de streptavidine (carrés ouverts) et après le greffage des protéines IgG (carrés pleins), droite : comparaison des facteurs de rectification en fonction du pH, avant (hachurées) et après (pleines) le greffage d’IgG à NaCl

100 mM. a. b. rouge: NP22PEGbiot, contient les longues chaines biotine-PEG et des streptavidines, c. d. bleu:

NP24Biot, contient les courtes chaines de -biotines et les streptavidine

Ensuite nous nous intéressons à une autre protéine modèle, la BSA. Le principe reste le même, seul le point isoélectrique de la protéine change (IEP 4,7). Nous avons étudié la détection de la BSA biotinylée grâce à un nanopore fonctionnalisé avec de l’avidine. Ce choix est motivé par le fait que les deux protéines présentent des charges globales opposées de pH 5 à 10. Ainsi en utilisant ces conditions, nous espérons observer une inversion de la forme des courbes I-V due au greffage des BSA. Les facteurs de rectifications de la Figure 49 ne montrent pas l’inversion attendue. Dans le cas des chaines courtes, l’addition des BSA biotinylées induit une augmentation du facteur de rectification de pH 5 à 8, et une diminution pour les pH 4, 9, et 10. La BSA possède une charge globale positive à pH 4, et négative au-dessus de pH 4,7, les groupements amines sont chargés jusqu’à pH 9-10. Une explication possible peut être que le facteur de rectification augmente lorsque l’intérieur du pore présente des charges globales opposées de pH 5 à 8. Il est à noter également, qu’après l’insertion de BSA, le courant de rectification est de 1 pour les pH 9-10. Pour les longues chaines, une augmentation du facteur de rectification est également observée pour des pHs de 6 à 9.

a b

Chapitre 3. Nanopore fonctionnalisé stimuli-répondant

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Enfin, dans l’objectif de déterminer l’aptitude de notre approche à détecter l’addition successive de protéines, des anticorps d’anti-BSA ont été ajoutés après le greffage des BSA. Les courbes I-V après l’addition d’anti-BSA montrent une inversion du facteur de rectification dans le cas de la chaine longue à pH 6 et 7. Au contraire, quand l’anti-BSA est ajouté sur des chaines courtes, il n’y a aucune inversion de courant significative. Cependant, la modification du facteur de rectification à bas pH (de 4 à 6) permet tout de même de détecter l’anti-BSA. D’autre part, indépendamment de la longueur de la chaine, à pH basique (9-10), le facteur de rectification est quasi identique avant et après l’ajout de l’anticorps.

Figure 49: Insertion de biotine-PEG-BSA et anti BSA, courbes I-V à NaCl 100 mM, noir: NP26PEGbiot,

longues chaines biotine-PEG et avidine, a. (croix) après insertion d’avidine, (carré ouvert) après insertion de biotine-BSA, (carré plein) après insertion d’anti-BSA, b. Facteur de rectification en fonction du pH (blanc) après insertion d’avidine, (gris) après insertion de biotine-BSA, (noir) après insertion d’anti-BSA,

vert: NP18biot, contient de courtes chaines de -biotines et de l’avidine, c. (croix) après insertion d’avidine,

(carré ouvert) après insertion de biotine-BSA, (carré plein) après insertion d’anti-BSA, d. Facteur de rectification en fonction du pH (rayé) après insertion d’avidine, (hachuré) après insertion de biotine-BSA, (plein) après insertion d’anti-BSA

a b

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