Rationalité des mutants construits

Cette étude, unique dans la littérature, propose donc un criblage à l’alanine appelée aussi

« alanine screening » sur les résidus les plus conservés dans les PLDα végétales en utilisant comme modèle l’AtPLDα recombinante (cf. 1.3.3.10. Modulation de l’activité PLD par mutagenèse dirigée).

Notons qu’une partie des résidus ciblés et conservés sont communs avec la PLD humaine, ce qui nous permettra, par le truchement de l’homologie, de transposer les constatations catalytiques aux PLD de mammifères.

Les résidus ciblés sont mutés par mutagenèse dirigée. La mutation est introduite au cours d’une PCR effectuée sur le plasmide d’expression pGAPZB avec des amorces contenant l’erreur à introduire dans l’ADN. La Figure 24A représente la position relative des résidus mutés dans la structure primaire de l’AtPLDα (Figure 24A). La Figure 24B représente la position de ces résidus dans un alignement de la PLD avec les PLD1 et 2 humaines, soulignant ainsi les résidus mutés en commun avec la PLD humaine (Figure 24B).

Dans un premier temps, nous avons ciblé les résidus des motifs catalytiques tels qu’ils sont décrits dans la littérature. Ceci permet en effet de valider notre système d’expression et notre capacité à produire et à détecter l’AtPLDα dont on sait que le type sauvage est actif (Rahier et al., 2016a) et que les mutants des résidus catalytiques doivent être inactifs (Lerchner et al., 2006). Ainsi les mutants du premier motif H332A, K334A et D339A et du second H661A, K663A et D668A sont réalisés (Figure 24).

143 Figure 24 : Positionnement des mutations de l’AtPLDα.

A) Représentation schématique de la position des mutants dans la structure primaire de l’AtPLDα.

B) Alignement de la PLD d’A. thaliana (AtPLD) avec les PLD1 et 2 humaines (HsPLD, Homo sapiens).

À partir de la fin du domaine C2, les résidus alignés parmi les trois séquences sont en gris clair, les résidus similaires en gris foncés et alignés avec au moins deux des trois séquences et la séquence consensus des PLD végétales sont conservés à au moins 95 %. Les résidus similaires en noir et alignés avec au moins deux des trois séquences et la séquence consensus des PLD végétales sont conservés à 100 %. Les résidus mutés dans l’AtPLDα sont indiqués par une étoile rouge.

144

Dans un second temps nous avons élargi le spectre de mutation puis muté les résidus à la fois conservés et à proximité de ces motifs catalytiques. Pour le premier motif, il existe un doublet d’histidyl dont le second H est décrit comme catalytique (H332). Nous vérifierons s’il existe une différence entre les deux résidus en mutant le résidu non décrit à présent (H331).

Parallèlement au second motif, un résidu séryl est situé huit résidus après l’aspartyl (D) catalytique. Étant très conservé il est, lui aussi, muté et remplacé par un résidu alanyl (S348A).

Dans le second motif, les résidus conservés sont plus nombreux ; nous avons muté le Y659A situé deux positions avant l’histidyl (H) catalytique. Entre les résidus K et D catalytiques nous avons muté l’I666 parfaitement conservé. Dans ce HKD C-terminal, il existe un doublet d’aspartyl dont seul le premier est décrit dans la littérature. Nous mutons donc le deuxième afin d’élucider son rôle plus précisément (D669A). On retrouve aussi le résidu séryl à huit positions du D catalytique S676A. Tout le motif en aval du HKD C-terminal est parfaitement conservé et il est muté ponctuellement dans son ensemble : G675A, S676A, A677V, N678A, N680A, R682A, S683A, M684V. Notons que pour muter l’A677 nous avons opté pour un résidu valyl structurellement proche de l’alanyl malgré un encombrement stérique et une hydrophobicité plus importantes. La mutation M684V est une mutation aléatoire obtenue au cours d’une PCR de mutagenèse dirigée.

Deux résidus supplémentaires sont mutés en aval de ce domaine HKD. En se basant sur les structures à hautes résolution de la PLD procaryote de Streptomyces sp. PMF les H catalytiques sont stabilisés par des résidus D (Leiros et al., 2004). On peut identifier ces résidus sur un alignement où le D202 de Streptomyces sp. stabilisant le H448 du motif HKD C-terminal se retrouve aligné avec le D407 chez A. thaliana. On décrit ci-dessous la mutation du D407 dans un domaine conservé (D407A). Le second aspartyl D473 de Streptomyces sp. stabilise le H170 du motif HKD N-terminal. Dans ce cas, son pendant chez A. thaliana n’est pas clair sur l’alignement. Cependant, en modélisant la structure de la PLD végétale par homologie avec la PLD bactérienne, deux résidus sont de bons candidats pour stabiliser l’histidyl catalytique ; il s’agit du D689 localisé à 3,9 Å du H332 et du E691 situé à 2,8 Å (Figure 25). Ces deux résidus sont mutés (D689A et E691A) car le D689 s’aligne mieux mais le E691 est plus proche et situé à la même distance de l’H332 catalytique que l’est le D407 du H661.

145

Figure 25 : Représentation structurale des D stabilisant le H catalytique.

A) Représentation du site catalytique de la PLD de Streptomyces Sp. PMF (PDB : 1v0s). B) Représentation du site catalytique de l’AtPLDα modélisé par homologie.

La description des mutants suivants s’effectue de la partie N-terminale à la partie C-terminale de la séquence consensus.

Nous avons ciblé des résidus appartenant à des motifs parfaitement conservés dans la séquence consensus et que l’on retrouve dans les PLD de mammifères. Dans un motif riche en lysyl

"LLKKK" (position 313) chez les végétaux et "LLKRK" dans les PLD1 et 2 humaines nous avons muté le dernier résidu K261A.

Comme indiqué ci-dessus dans le motif "PREPWHDIH", identique et retrouvé dans les PLD humaines (Figure 24B), nous avons effectué les mutations des résidus parfaitement conservés P401A, R402A, P404A, W405A et D407A.

Dans le motif "FIYIENQYFKG" nous avons muté le résidu glutamyl Q522A.

En aval de ce motif se trouve un domaine hydrophobe riche en valyl "FTVYVVV" chez les végétaux, et respectivement "YRVYVVI" et "YRVYVLL" dans la PLD1 et PLD2 humaines.

Afin d’étudier l’importance du résidu aromatique conservé dans ce domaine particulier (F chez les végétaux, Y chez l’Homme) nous l’avons muté également (F565A) (Figure 24).

En ciblant ces résidus nous pourrons extrapoler l’importance de ces domaines dans la PLD humaine. Dans le même esprit, trois autres résidus conservés entre la PLD humaine 1 et 2 et les PLD végétales mais ne faisant pas pour autant partie de domaines caractéristiques sont mutés : P771, G778, et G798.

Enfin, dans le motif terminal "PPILTT" nous avons effectué les mutations P805A, T809A, T809S et T810A. Pour ce motif et pour la mutation des deux derniers résidus, nous nous basons sur les données de la mutagenèse dirigée effectuée sur la PLD de chou (Lerchner et al., 2006).

Lors de ces travaux les auteurs montrent que le mutant du résidu terminal T810A perd l’activité

146

enzymatique. À l’inverse, l’activité enzymatique est préservée lorsque le résidu tyrosyl est remplacé par un séryl (T810S) mettant en lumière l’importance du groupement hydroxyle dans la catalyse à cette position. Nous complétons cette étude en reproduisant ce même mutant T810A et focalisons le changement de résidu sur le résidu précédent tout aussi bien conservé (T809) en mutant à la fois en T809A et T809S.

Au cours des PCR de mutagenèse dirigée nous avons obtenus cinq mutations aléatoires en plus des mutations désirées:

Nous avons cherché à isoler ses mutations couplées pour pouvoir tester leur implication dans la catalyse enzymatique d’AtPLD. Les mutations P208S et A289V ont été isolées en utilisant l’enzyme de restriction MfeI dont un site existe dans le promoteur pGAP en 5’ du gène et un autre dans AtPLDα en position 1394. Ainsi le fragment d’ADN digéré par MfeI de 1410 pb a pu être inséré dans le plasmide codant AtPLDα sauvage digéré avec la même enzyme de restriction et déphosphorylé.

Les mutations A85S (couplée à H332A) et R65G (couplée à S348A) ont été isolées en utilisant l’enzyme HindIII dont deux sites existent dans le gène codant AtPLDα en position 434 et 2206.

Pour isoler A85S et H332A, le fragment libéré par l’enzyme HindIII (1772 pb) porte la mutation H332A, il est transposé dans le plasmide codant AtPLDα sauvage digéré avec la même enzyme de restriction et déphosphorylé. Le fragments HindIII/HindIII sauvage est transposé dans le plasmide contenant la mutation résiduelle A85S. Il en est de même pour isoler R65G et S348A.

La mutation P415T est dans un plasmide contenant AtPLDα étiquetée en N-terminale avec six histidines. En utilisant l’enzyme XhoI dont un site existe avant l’ATG initiateur et un second site existe dans AtPLDα en position 727, on cherche d’abord à isoler la mutation A35L. Ainsi le fragment XhoI/XhoI de 763 pb portant la mutation A35L est transposé dans le plasmide codant l’AtPLDα -6xhis-Nt digéré par XhoI et déphosphorylé. La mutation P415T est isolée en transposant le fragment XhoI/NotI de 1708 pb dans un plasmide codant AtPLDα sauvage digéré par les mêmes enzymes de restriction.

La mutation M684V existait déjà à mon arrivée au laboratoire et a été obtenue au cours d’une

147

PCR sur le gène AtPLDα. M684, R65 et P415 sont des résidus conservés à plus de 95 %, A85, P208 et A289 sont conservés à plus de 90 %.

C’est donc une banque de 41 mutants que nous avons construite pour être exprimée et testée dans la levure P. pastoris. Parmi ces 41 mutants, 33 sont en commun avec la PLD1 et/ou la PLD2 humaine. Ainsi cette étude propose, par le biais de l’homologie de séquences entre les PLD végétales et humaines, d’étudier les résidus de la PLD humaine les plus conservés dans le vivant.