Criblage de conditions de cristallogenèse

Afin d’homogénéiser la solution et d’exclure les contaminants, chaque essai de cristallogenèse est précédé d’une chromatographie par filtration sur gel. Cette chromatographie d’exclusion est plus précise que pour le SEC/MALS car on utilise une colonne plus résolutive (Superdex S200 Increase). On observe ainsi un premier pic en début de chromatogramme avec des absorbances à 254 et 280 nm équivalentes. Ce pic est typique d’un aggrégat de protéines et d’acides nucléiques non retenues sur la colonne. Un second pic plus faible apparaît dans les fractions 15 à 18, l’absorbance indique qu’il s’agit de protéines. Enfin, un pic majeur à partir de la fraction 20 avec une absorbance à 280 nm plus importante indique l’élution de la PLD (Figure 32A).

165 Figure 32 : Chromatographie par filtration sur gel.

A) Chromatographie sur Superdex S200 Increase avec lecture UV à 280 nm (protéine) et 254 nm (acides nucléiques). B) Analyse par SDS-PAGE (10 %) des fractions d'élution 1 à 5 puis 14 à 31. MM : marqueur de masse moléculaire.

L’analyse de ces fractions par SDS-PAGE indique que le pic majeur contient bien la PLD à 90 kDa. Le pic minoritaire situé en amont (fractions 15 à 19) contient une protéine à 60 kDa en condition dénaturante. Puisqu’elle est exclue avant la PLD, cela suggère qu’il s’agit d’une protéine dimérique à 120 kDa en condition native. Celle-ci constitue alors le principal contaminant de la purification sur Octyl Sépharose^®. Enfin, l’aggregat initial ne contient pas de protéines détectables sur ce type de séparation. Celles-ci sont peut-être trop importantes en masse ou bien il s’agit d’acides nucléiques (Figure 32B).

Au cours de cette étape nous parvenons donc à exclure le contaminant à 60 kDa en conditions dénaturante. C’est avec la réunion des fractions 22 à 30 de la Figure 32B que nous allons cribler des conditions de cristallogenèse.

3.1.2.2.3.1. Premier criblage

Lors du premier criblage nous avons testé des conditions de cristallisation identiques et proches de celles pour lesquelles de précédents chercheurs avaient obtenu des cristaux de la VuPLD recombinante (Abergel et al., 2001). La protéine est concentrée à 7 mg/mL, nous utilisons la technique de diffusion de vapeur en goutte suspendue sur une plaque 24 puits où les gouttes sont effectuées à la main. Au cours de cette méthode, les interactions solvant-protéines sont remplacées progressivement par des interactions protéines-protéines. Un équilibre s'établit progressivement entre la solution de cristallisation en excès dans un réservoir et une goutte contenant la protéine concentrée. La diffusion de la vapeur d'eau, de la goutte vers le réservoir, permet une concentration lente de la protéine ; ceci conduit soit à la formation de cristaux à partir de la zone de nucléation soit à la précipitation.

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Figure 33 : Criblage de conditions de cristallogenèses, boîte 1.

Les concentrations des solutions sont indiquées dans chaque puits. La protéine à 7 mg/mL (1 μL) est mélangée à 1 μl de la solution du puits. Chaque puits contient 500 μl de la solution de cristallogenèse.

Les puits grisés sont les conditions pour lesquelles des cristaux ont été obtenus (Abergel et al., 2001).

Le puits surligné en rouge correspond à une condition où des cristaux sont obtenus.

En plus de cette plaque (Figure 33) une plaque à 96 puits a été remplie au robot Mosquito avec 100 nL de protéine à 7 mg/mL et 100 nL de solution de cristallogenèse. Les kits "Hampton Research Crystal screen" 1 et 2 ont été utilisés (48 puits chaque). Ici, nous utilisons la technique de la goutte assise (cf. 2.3.2. Cristallographie). Le principe est toujours le même, soit la diffusion de vapeur, la position de la goutte par rapport au réservoir change. Elle est à côté du réservoir (goutte assise) plutôt que suspendue au-dessus (goutte suspendue). Cette technique est préférée lorsque les gouttes sont effectuées avec un robot.

À l’issue de ce premier criblage, trois conditions ont montré des cristaux de protéines : la condition A1 (plaque 24 puits) imidazole 0,1 M pH 8,5, (NH4)2SO4 1,4 M (Figure 33), les cristaux sont des aiguilles fines (Figure 34A). Des cristaux apparaissent (plaque 96 puits) dans la condition Tris sodium citrate 0,1 M pH 5,6, isopropanol 20 %, PEG 4 000 20 %. (Figure 34B). Des cristaux apparaissent (plaque 96 puits) dans la condition HEPES 100 mM pH 7,5, PEG 400 2 %, sulfate d’ammonium 2 M. (Figure 34C).

167 Figure 34 : Cristaux de VuPLD, premier criblage.

A) Condition A1 : imidazole 0,1 M pH 8,5, (NH4)2SO4 1,4 M. B) Tris Sodium Citrate 0,1 M pH 5,6, isopropanol 20 %, PEG 4 000 20 %. C) HEPES 100 mM pH 7,5, PEG 400 2 %, (NH4)2SO4 2 M.

Ces cristaux ont plusieurs défauts :

- ils sont très petits, très fins ou en aiguilles et donc difficiles à pêcher ;

- ils sont peu nombreux, on ne retrouve que deux ou trois cristaux par goutte (Figure 34A) ;

- la condition de la Figure 34B est difficile à maîtriser car elle contient de l’isopropanol qui s’évapore entre la préparation et l’ouverture du puits.

Notons qu’hormis les cristaux en aiguilles de la Figure 34A qui approchent les conditions déjà publiées (Abergel et al., 2001) (1,6-1,7 M (NH4)2SO4, 0,5 M NaCl, 0,1 M imidazole pH 8,5), les cristaux de la Figure 34B et C sont des conditions nouvelles.

3.1.2.2.3.2. Deuxième criblage

Le second criblage se focalise autour des conditions fructueuses du premier criblage afin de reproduire ces cristaux et d’affiner les conditions pour en obtenir de plus gros et de plus nombreux.

La protéine est concentrée à 9 mg/mL. Nous utilisons la technique de la goutte suspendue sur une plaque 24 puits où les gouttes sont effectuées à la main.

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Figure 35 : Criblage des conditions de cristallogenèses, boîte 2, 3 et 4.

Les concentrations des solutions sont indiquées dans chaque puits. La protéine à 9 mg/mL (1 μL) est mélangée à 1 μL de la solution du puits. Chaque puits contient 500 μL de la solution de cristallogenèse.

Les puits surlignés en rouge correspondent à une condition où des cristaux ont été obtenus.

169 Figure 36 : Cristaux de VuPLD, second criblage.

A) Condition D4 boîte 3 : Tris Sodium Citrate 0,1 M pH 5,6, isopropanol 25 %, PEG 4 000 20 %.

B) Condition D5 boîte 3 : Tris Sodium Citrate 0,1 M pH 5,6, isopropanol 25 %, PEG 4 000 22 %.

C) Condition B2 boîte 4 : HEPES 100 mM pH 7,5, PEG 400 1,5 %, (NH4)2SO4 1,9 M. D) Condition C2 boîte 4 : HEPES 100 mM pH 7,5, PEG 400 2 %, (NH4)2SO4 1,9 M.

Les cristaux en Figure 36A et B sont des cristaux de sels. Nous avons essayé de pêcher le cristal en condition B2 de la boîte 4 (Figure 36C) sans succès car la solution a précipité au moment de pêcher le cristal. Le cristal de la condition C2 de la boîte 4 (Figure 36D) a été pêché puis congelé dans une solution de congélation composée de Tris Sodium Citrate 0,1 M pH 5,6, isopropanol 10 %, PEG 4 000 25 %, PEG 400 30 %.

3.1.2.2.3.3. Troisième criblage

Le troisième criblage reprend les conditions expérimentales du premier criblage, cette fois-ci en faisant varier le pH et non plus la concentration en sel (boîte 5). La boîte 6 crible des conditions autour des cristaux en aiguilles obtenus lors du premier criblage (imidazole 0,1 M pH 8,5, (NH4)2SO4 1,4 M). La protéine est concentrée à 8 mg/mL. Nous utilisons la technique de la goutte suspendue sur une plaque 24 puits où les gouttes sont effectuées à la main.

Aucun cristal n’a été obtenu au cours de ce criblage.

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Figure 37 : Criblage des conditions de cristallogenèses, boîtes 5 et 6.

Les concentrations des solutions sont indiquées dans chaque puits. La protéine à 8 mg/mL (1 μL) est mélangée à 1 μL de la solution du puits. Chaque puits contient 500 μL de la solution de cristallogenèse.

3.1.2.2.3.4. Quatrième criblage

Au cours de la concentration de la protéine lors de la préparation de l’échantillon, celle-ci a précipité au-delà d’une concentration de 1 mg/mL. Nous avons alors ajouté du NaCl à une concentration finale de 200 mM. Ceci nous permet de concentrer la protéine à 2,4 mg/mL.

Ici nous criblons de nouvelles conditions de cristallogenèse à l’aide d’un robot Mosquito avec 100 nL de protéine à 2,4 mg/mL et 100 nL de solution de cristallogenèse. Nous criblons 6 boîtes de 96 conditions avec des solutions de cristallogenèse issues de kits commerciaux :

- Classics-Suite qiagen ; - JCSG MD ;

- PACT MD ; - PEGs-I qiagen ; - Salt-Grid hampton ; - Wizard_I+II rigaku.

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Au cours de ce criblage nous avons pu observer des sphérulites (Figure 38) qui correspondent à un début de précipité cristallin dans les conditions suivantes :

- Condition C11 du Kit PEGs-I quiagen : 0,1 M Mes pH 6,5, 20 % PEG 10 000.

- Condition F10 du Kit PACT MD : 0,02 M Sodium/Potassium Phosphate, 0,1 M BisTris Propane pH 6,5, 20 % PEG 3 350.

Figure 38 : Précipités cristallins de VuPLD obtenus au cours du quatrième criblage.

A) Condition C11 du Kit PEGs-I qiagen : 0,1 M Mes pH 6,5, 20 % PEG 10 000. B) Condition F10 du Kit PACT MD : 0,02 M Sodium/Potassium Phosphate, 0,1 M BisTris Propane pH 6,5, 20 % PEG 3 350.

3.1.2.2.3.5. Cinquième criblage

Avec la protéine issue de la même préparation que lors du quatrième criblage nous avons criblé autour des conditions des sphérulites obtenues (Figure 38) dans quatre boîtes. Nous utilisons la technique de la goutte suspendue sur deux plaques 24 puits où les gouttes sont effectuées à la main.

Dans la condition A6 de la boîte 9 deux petits cristaux sont observés. Leur collecte ainsi que la collection des données de diffraction correspondantes sont en cours.

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Figure 39 : Criblage de conditions de cristallogenèses, Boîtes 7, 8, 9 et 10.

Les concentrations des solutions sont indiquées dans chaque puit. La protéine à 2,4 mg/mL (1 μL) est mélangée à 1 μL de la solution du puits. Chaque puits contient 500 μL de la solution de cristallogenèse.