Proposition d’un modèle 3D de l’AtPLD

« Tous les modèles sont faux, mais certains sont utiles. » Georges Box

Les modèles obtenus sont assez fidèles à notre postulat de départ sur la topologie générale de chaque lobe de la PLD (Figure 52A et B). Ainsi, le lobe du côté N-terminal présente une topologie de type : α-β-α-β-α-β-α-β-β-β-α-β-α-β. À la différence de ce que nous avions prédit (Figure 50 et Figure 51), deux petites hélices α supplémentaires ont été modélisées, l’une à la place du premier brin et l’autre entre deux brins en fin de séquence.

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Le lobe du côté C-terminal présente une topologie de type : α-β-α-β-α-β-β-β-β-α-α. À l’inverse du précédent, le lobe côté C-terminal est modélisé sans les deux brins β initiaux ni le brin β terminal.

Les différences que l’on observe entre notre prédiction et les modèles calculés sont dus aux critères que nous avions établis en 3.1.2.3.2. Analyse de la structure secondaire, nous avons négligé les hélices et les brins de moins de quatre résidus et les structures secondaires non alignées.

Notons que l’hélice α supplémentaire au milieu des quatre brins β dans le lobe côté N-terminal n’existant pas dans notre prédiction de structure, il est étonnant de la trouver ici. À l’inverse, l’hélice α supplémentaire en fin de séquence du lobe côté C-terminal existe bel et bien dans notre alignement de structures secondaires (Figure 49). De façon plus générale il semble que les serveurs de modélisations n’arrivent pas ou peu à modéliser les extrémités de cette protéine.

On explique ainsi les différences présentent aux extrémités par rapport à nos modèles.

Le modèle calculé de la PLD entière sans domaine C2 (Figure 52C) indique un repliement globalement très proche de ce que l’on peut observer lobe par lobe (Figure 52A et B). Ce modèle est peu fiable et, comme précédemment, il génère d’autres structures secondaires non prédites précédemment. Ceci est dû à un taux d’identité faible avec l’homologue. Il faut ajouter à cela que les boucles modélisées sont très peu fiables. Il y a tout lieu de penser que ce sont la taille des boucles de la PLD végétales, plus importantes que celles de la PLD bactérienne, qui abaissent le taux d’identité avec l’homologue.

Figure 52 : Modèles de l’AtPLDα sans son domaine C2.

A) Modèle du lobe Nt. B) Modèle du lobe Ct. C) Modèle de la PLD entière sans le domaine C2. Les structures sont représentées avec des boucles simplifiées en vert, les hélices α sont en rouge et les brins β sont en jaune.

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Cette topologie s’organise autour des six brins β qui forment un feuillet β central avec trois hélices α d’un côté dans le même sens que les brins β et la quatrième de l’autre côté perpendiculaire au feuillet (Figure 53).

Figure 53 : Proposition de repliement général d’un des deux lobes du cœur catalytique des PLD.

Les flèches représentent les brins β, les cylindres représentent les hélices α. N : extrémité amino-terminale. C : extrémité carboxy-amino-terminale.

3.1.2.3.5. Conclusions & perspectives

Cette étude in silico nous permet de conclure que les PLD bactériennes et végétales possèdent un repliement commun. À partir des quatre domaines décrits (Ponting and Kerr, 1996), nous avons pu associer des structures secondaires conservées. Ceci nous permet aussi d’élargir notre analyse en constatant le fait que ces domaines existent aussi dans la PLD humaine. Nous postulons donc ici qu’il y aurait un repliement commun aux lobes constituant le cœur catalytique de toutes les PLD du vivant. Ce repliement suivrait cette topologie :

α - β - α - β - α - β - β - β - β - α.

Nous ne postulons pas sur les structures secondaires en amont ou en aval de ce repliement car nos modèles et prédictions ne s’accordent pas.

Nous pouvons aussi conclure sur le fait que toutes les PLD du vivant sont organisées en deux lobes se faisant face en miroir l’un à l’autre et avec un repliement commun. Comme décrit dans la structure de la PLD de Streptomyces sp. PMF, les motifs HKD constituant la poche catalytique se retrouvent dans le creux de la structure formée par les deux lobes dont la forme globale s’apparente à une selle de cheval.

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Ainsi, il est possible de localiser de façon relative les mutants effectués au cours de la première partie de ce chapitre (Figure 54).

Figure 54 : Position relative des mutants de l’AtPLD dans un modèle topologique du repliement 3D de l’enzyme.

Les mutants sont représentés par des étoiles rouges. Les étoiles bleues représentent les mutants qui n’affectent pas l’activité catalytique de l’enzyme.

On note que la majorité des mutants effectués sont localisées au niveau des structures secondaires conservées. Nous n’avons pas souhaité représenter la boucle reliant les deux motifs car aucune information n’émerge de nos modèles (Figure 52). De la même façon, les structures secondaires ne sont pas représentées à l’échelle car des divergences apparaissent entre le début et la fin des structures secondaires selon les données de prédiction à partir de la séquence (Figure 49) et la modélisation 3D (Figure 52).

À l’heure actuelle, nous sommes limités par le peu d’homologues des PLD dont la structure existe, ce qui nous empêche de construire des modèles fiables. Ici, nous avons postulé à partir de la structure bilobée d’un repliement commun entre les lobes, ce qui nous a permis de limiter la taille des séquences à modéliser en modélisant chaque lobe de façon indépendante.

Nous ne sommes pour autant pas en capacité de positionner les domaines régulateurs des PLD.

En effet si notre étude postule un repliement général des PLD du vivant, la différence entre toutes ces enzymes réside principalement dans les domaines régulateurs. Il s’agit chez les PLD végétales du domaine C2 responsable de la fixation du Ca²⁺ et des domaines PX et PH pour les PLD de mammifères responsables de la fixation de petites protéines G et de phosphoinositides.

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Ces domaines situés à part du cœur catalytique sur lequel nous avons travaillé ont, pour certains, une structure 3D déjà identifiée. En réalité c’est la position de ces domaines régulateurs par rapport au cœur catalytique qui demeure un mystère. Notre étude de SAXS (cf. 3.1.2.2.5.

Analyse structurale par SAXS et modèle à basse résolution) cherchait à identifier cette position en observant un mouvement de domaine entre la forme protéique active avec Ca²⁺ et inactive sans Ca²⁺. Ceci aurait pu nous indiquer la position du domaine C2.

De même, notre étude cristallographique avait pour but de donner une structure aux PLD eucaryotes. L’un des espoirs pour déterminer la structure de ces enzymes réside dans la microscopie électronique. Aujourd’hui des structures à l’échelle atomiques peuvent être résolues grâce à cette technique qui ne demande pas de cristaux et qui est plus résolutive que le SAXS. Cependant, ceci n’est valable que pour les gros complexes protéiques entre 150 et 200 kDa minimum. On peut penser qu’il est plus probable d’obtenir la structure de la PLD humaine (120 kDa) par cette technique ; mais devant les difficultés d’accumuler cette enzyme particulière (Brown et al., 2007), il semble à ce jour que le plus efficace reste notre stratégie d’utiliser la PLD végétale, seule PLD eucaryote purifiée à homogénéité, comme outil pour obtenir la structure des PLD eucaryotes par cristallographie.

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3.2. Chapitre 2 : Domaine catalytique minimal,