Analyse structurale par SAXS et modèle à basse résolution

De façon à avoir une information structurale sur la VuPLD et parce que nous avions des quantités suffisantes de cette protéine dans des conditions exploitables, nous avons effectué des expériences de SAXS.

Le SAXS est une technique de mesure de la diffusion de rayons X à travers une solution de protéine. Elle permet l’analyse structurale, l’étude de processus cinétiques, de transitions structurales ou de changements conformationnels des macromolécules biologiques en solution.

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Cette méthode ne requiert pas de cristaux et n’est pas limitée par la taille de la macromolécule, ce qui la rend applicable dans des conditions physiologiques (cf. 2.3.3. Diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)).

Nous avions déjà observé le caractère homogène de la PLD en solution ; cependant les dernières préparations avaient une tendance importante à précipiter à de faibles concentrations. Ainsi, pour réaliser les expériences de SAXS, on effectue d’abord une chromatographie par filtration sur gel de l’échantillon protéique pour exclure les agrégats.

Toutes les expériences de SAXS sont réalisées avec l’échantillon de VuPLD du dernier criblage de cristallogenèse (purification n^o 30 à 45 Tableau 5) Cet échantillon a déjà été purifié par filtration sur gel. Nous testons quatre conditions afin de s’affranchir le plus possible d’agrégats protéiques :

- Après la première filtration sur gel, l’échantillon est conservé à -80 °C - Après la première filtration sur gel, l’échantillon est conservé à 4 °C - L’échantillon est re-purifié par filtration sur gel et conservé à -80 °C - L’échantillon est re-purifié par filtration sur gel et conservé à 4 °C

Nous testons plusieurs concentrations protéiques de 2,55 à 0,015 mg/mL afin d’éviter de faire diffuser des agrégats de protéine.

Seules les concentrations les plus élevées, 2,5 mg/mL et 1 mg/mL, nous permettent d’étudier la protéine et de pouvoir modéliser à partir du signal obtenu (Figure 42).

Figure 42: Analyse structurale de VuPLD par SAXS.

I est l’intensité des vecteurs de diffusion et S est l’inverse de la taille de ces vecteurs (nm^-1). A) Courbe de diffusion log(I) par rapport à S. B) La courbe de Kratky I x S² par rapport à S indique que la protéine est repliée.

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Après purification par filtration sur gel et conservation de la protéine à -80 °C, le SAXS nous permet de déterminer le rayon de giration (Rg) de la protéine qui est de 2,81 +/- 0,05 nm, un diamètre maximum (Dmax) de 9,89 nm et une masse théorique de 89,11 kDa. La courbe de Kratky (I*S² par rapport à S en nm^-1) est une représentation illustrant le repliement de la protéine (cf. 2.3.3. Diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)). Par comparaison, la masse théorique calculée à partir de la séquence est de 91,5 kDa ce qui est assez proche des 89,11 kDa déterminés en SAXS ; le Rg est quasiment le même que pour la PLD de chou (2,89 +/- 0,01 nm) (Stumpe et al., 2007). Par contre, il semble que la VuPLD soit plus allongée que la PLD de chou dont la Dmax est de 8,5 nm (Figure 14).

Figure 43 : Modèles calculés à partir des données SAXS.

A) Calcul avec le programme DAMMIN (20 cycles). B) Calcul avec le programme GASBOR (50 cycles).

Le programme DAMMIN (Svergun, 1999) modélise une protéine symétrique (Figure 43A) en forme d’ovoïde avec des extrémités effilées et un cœur plus élargi. Ce modèle est assez proche de celui obtenu par l’équipe de Renate Ulbrich-Hoffman (Stumpe et al., 2007) avec la PLD de chou. Le modèle proposé par le programme GASBOR (Svergun et al., 2001) est moins symétrique (Figure 43B). Ce modèle possède une base plus importante, un cœur élargi et une extrémité en pointe dénotant dans ce cas une relative asymétrie.

Ces deux modèles (Figure 43) demeurent proches du modèle de la PLD de chou. La partie flexible décrite par Stumpe et al. ne semble pas aussi évidente ici et il est difficile de savoir s’il s’agit d’une réelle différence entre les protéines ou bien d’une différence expérimentale. Par ailleurs cette enveloppe ne permet pas d’identifier la position du domaine C2.

Le domaine C2 est le domaine régulateur de la PLD qui fixe le Ca²⁺, cofacteur indispensable à l’activité enzymatique. Il semble que la fixation du Ca²⁺ entraîne un bouleversement structural

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(Zheng et al., 2000) permettant l’exposition de zones hydrophobes à la surface de la protéine et favorisant ainsi son adsorption aux membranes.

En comparant, le modèle SAXS de la PLD avec et sans Ca²⁺ nous avons l’opportunité d’observer ce changement structural et donc de définir la position relative du domaine C2 par rapport au cœur catalytique. À cette fin, nous avons essayé de reproduire la même expérience en présence de l’activateur de l’enzyme, 20 mM de Ca²⁺ qui est la concentration à laquelle l’activité PLD est mesurée en présence du substrat dans des micelles mixtes de SDS/Triton-X100.

Figure 44 : Analyse structurale de VuPLD par SAXS en présence de Ca²⁺.

La courbe noire correspond aux données de SAXS sans Ca²⁺, la courbe jaune correspond aux données de SAXS en présence de 20 mM de Ca²⁺. A) Courbe de diffusion. B) La courbe de Kratky indique que la protéine est repliée en noire et présente une dénaturation partielle en jaune.

De façon tout à fait surprenante on observe une dénaturation partielle de l’enzyme en présence de Ca²⁺ (Figure 44B). Un tel phénomène ne nous permet pas de modéliser la protéine en présence de son activateur.

La concentration de Ca²⁺ que nous avons testée n’est pas une concentration physiologique. Elle nous permet de mesurer l’activité PLD au cours d’un test enzymatique où :

- la PLD est en présence de substrat (PC/SDS/Triton), d’une sonde fluorescente ou bien d’enzymes reportrices pour quantifier la libération du produit ;

- la quantité d’enzyme utilisée est beaucoup moins importante qu’en SAXS. En SAXS, nous préparons 50 μL d’une solution à 1 mg/mL minimum. Ceci correspond à 50 μg de protéine. Dans un test enzymatique avec VuPLD pure nous utilisons 10 ng d’enzyme, soit 5 000 fois moins de protéines.

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Nous avons donc refait l’expérience mais en essayant plusieurs concentrations en Ca²⁺. Nous sommes restés à des concentrations où l’activité PLD est mesurable et compte tenu de la quantité restante en protéine nous avons fait quatre points à 0, 5, 10 et 20 mM de Ca²⁺ (Figure 45).

Figure 45 : Courbe de Kratky des données de SAXS en présence de 0 à 20 mM de Ca²⁺.

La courbe noire correspond aux données de SAXS sans Ca²⁺, la courbe orange correspond aux données de SAXS en présence de 5 mM de Ca²⁺, la courbe grise correspond aux données de SAXS en présence de 10 mM de Ca²⁺, la courbe jaune correspond aux données de SAXS en présence de 20 mM de Ca²⁺.

Dans cette expérience, réalisée avec le même échantillon que précédemment où la protéine a subi plusieurs cycles de congélations/décongélations, VuPLD est sensible à la concentration et précipite à partir de 0,8 mg/mL. Ici nous utilisons donc cette concentration qui ne nous permet pas d’obtenir un jeu de données de qualité suffisante pour calculer un modèle. Cependant on peut étudier le comportement de la protéine vis-à-vis du Ca²⁺.

Ces résultats confirment ce que nous voyions précédemment : il semble que le Ca²⁺ dénature partiellement la protéine. De fait, pour des concentrations croissantes en Ca²⁺ on observe une dénaturation de plus en plus importante (Figure 45).