Les lipases et phospholipases

La membrane est donc un véritable organe cellulaire dynamique qui est sujet à des modifications de sa structure et de ses propriétés biochimiques.

Nous montrions précédemment que les phospholipides étaient les composants majoritaires des membranes. Ce sont donc les premières cibles des enzymes lipolytiques sujettes à modification en réaction à un stress environnemental ou une réorganisation de la bicouche. Parmi ces enzymes, les lipases sont des carboxylester hydrolases qui agissent sur les glycérolipides et permettent la libération d’acides gras. Certaines d’entre elles sont tissu spécifique et on citera comme exemple l’Adipocyte Triglycéride Lipase (ATGL) responsable avec son cofacteur CGI-58 (Khatib et al., 2016) de l’hydrolyse des TG en libérant un acide gras et un DG. Les phospholipases quant à elles vont catalyser l'hydrolyse des fonctions ester carboxyliques et/ou phosphoriques des phospholipides membranaires. La modification des phospholipides permet de générer des molécules dérivées qui vont bouleverser la structure membranaire et donc les propriétés biochimiques de la cellule.

On distingue cinq types de phospholipases (Aloulou et al., 2018), réparties en deux catégories : - Les acylhydrolases :

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Figure 4. Action d’hydrolyse des différentes phospholipases sur la PC

1.2.1. Phospholipases A

Les PLA1 (EC 3.1.1.32) sont des acylhydrolases qui catalysent l’hydrolyse de la liaison ester carboxylique en position sn-1 des phospholipides et libèrent un 2-acyl-lysophospholipide et un acide gras (Figure 4). Les PLA1 possèdent la triade catalytique Ser-His-Asp typique chez les lipases ainsi qu’un repliement similaire de type α/β hydrolase, ces caractéristiques classent certaines PLA1 avec le groupe des lipases pancréatiques. Les PLA1 possèdent cependant un plus petit volet amphiphile couvrant le site actif et une boucle en moins (Aoki et al., 2007).

Certaines PLA1 sont très spécifiques de leur substrat. On distingue par exemple, les PS-PLA1

et les PA-PLA1, mais d’autres PLA1 ont une plus large capacité d’hydrolyse puisqu’elles peuvent hydrolyser aussi bien les phospholipides que les TG ou les galactolipides. Les lysophospholipides produits par la PLA1 sont d’importants médiateurs comme le lyso-PS ou le lyso-PA (Aloulou et al., 2018).

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1.2.2. Phospholipases A

Les PLA2 (EC 3.1.1.4) sont des acylhydrolases qui catalysent l’hydrolyse de la liaison ester carboxylique en sn-2 des phospholipides et libèrent un 1-acyl-lysophospholipide et un acide gras (Aloulou et al., 2018). La chaîne acyle située en sn-2 est généralement un acyl polyinsaturé qui, une fois libéré, peut être métabolisé pour former des médiateurs lipidiques tels que des eicosanoïdes.

Les PLA2 sont regroupées au sein d’une superfamille dans laquelle les enzymes partagent la même fonction catalytique. On distingue six types de PLA2 :

- La PLA2 cytosolique ou cPLA2 appartient à une famille de protéines qui comprend six isoformes différentes (Leslie, 2015). Elles contiennent toutes une diade catalytique Ser-Asp et un domaine C2 (Calcium-lipid Binding Domain) en N-terminal (à l’exception de l’isoforme γ). La fixation du calcium sur le domaine C2 permet un changement conformationnel et l’exposition de boucles hydrophobes qui vont pénétrer au sein de la membrane. L’activité catalytique est régulée par la phosphorylation de résidus séryls par des protéines kinases et l’interaction de la PLA2 avec des polyphosphoinositides.

- La PLA2 calcium-indépendante ou iPLA2 appartient à une famille de protéines qui comprend dix isoformes différents (Kienesberger et al., 2009). Elles contiennent toutes deux motifs consensus dont l’un est spécifique des lipases et l’autre est impliqué dans la fixation de nucléotides. Le site catalytique des iPLA2 est similaire à celui des cPLA2

et ne montre pas de spécificité de substrat particulière. On note des activités de type PLA1/PLA2, lysophospholipase, transacylase et thioesterase indiquant une grande diversité fonctionnelle au sein de cette famille d’enzymes (Aloulou et al., 2018).

- La PLA2 responsable de l’hydrolyse du platelet activating factor ou PAF-AH (Platelet Activating Factor AcylHydrolase) catalyse l’hydrolyse de l’acétate en position sn-2 du PAF. Cette famille d’enzymes comprend quatre membres calcium-indépendants dont un est sécrété et connu sous le nom de PAF-AH de type plasmatique ou associé aux lipoprotéines (Lp-PLA2). Les trois autres sont des enzymes intracellulaires appelées PAF-AH type II homologues au Lp-PLA2 et PAF-AH type I qui est composé d’un homo- ou hétérodimère de deux sous-unités catalytiques étroitement liées. Tous partagent un repliement typique α/β hydrolase et la triade catalytique Ser-His-Asp typique des lipases. La Lp-PLA2 en particulier semble jouer un rôle central dans la physiopathologie de l'athérosclérose, de son initiation à la progression des

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complications cardiovasculaires. De fait, les produits issus de l'hydrolyse des phospholipides oxydés par Lp-PLA2 sont pro-inflammatoires et jouent un rôle important dans l'inflammation et, par conséquent, dans l’athérosclérose (Wilensky et al., 2008).

- La PLA2 lysosomale (LPLA2) est une protéine localisée dans les lysosomes et caractérisée par un pH acide pour la catalyse. Il y a deux types de la LPLA2. La PLA2

calcium indépendante (aiPLA2 pour acidic calcium independent) et la LPLA2. La aiPLA2 possède une activité glutathion peroxydase en plus de l’activité PLA2. Ces deux activités sont situées sur deux motifs catalytiques différents au sein de l’enzyme. La LPLA2 est une protéine homologue de la lécithine cholestérol acyltransférase. Elle permet le transfert d’un groupement acyl sur un cholestérol pour former un ester de cholestérol (Hiraoka et al., 2006).

- La PLA2 adipocytaire ou adPLA2 est abondamment retrouvée dans le tissu adipeux blanc et permet la libération d’acide arachidonique au sein de ce tissu pour la synthèse des prostaglandines. Cette enzyme appartient de surcroît à la famille des lécithines rétinols acyltransférases. Une étude sur l’invalidation du gène de l’adPLA2 suggère que cette enzyme peut favoriser l'obésité grâce à un mécanisme distinct de la signalisation des prostaglandines (Wolf, 2009).

- La PLA2 sécrétée ou sPLA2 est une enzyme de faible masse moléculaire (14 à 19 kDa) qui contient une diade catalytique His/Asp. Cette enzyme est calcium dépendante et cible des phospholipides extracellulaires. On note onze isoformes différentes qui se distinguent notamment par leur spécificité tissulaire, leur spécificité de substrat et leur cofacteur (Murakami et al., 2015). Certaines PLA2 vont effectivement avoir un rôle défensif en ciblant préférentiellement le PE et le PG, composants majoritaires des membranes bactériennes.

L’assignation d’une PLA2 à un certain groupe est basée sur le mécanisme catalytique, la localisation et des caractéristiques structurales. Des propriétés pour lesquelles ces enzymes sont très diverses d’un groupe à l’autre (Aloulou et al., 2018).

1.2.3. Phospholipases B

Les PLB catalysent l’hydrolyse des liaisons esters en positions sn-1 et sn-2 des phospholipides et lysophospholipides (activité lysophospholipase EC 3.1.1.5) (Figure 4). Ces enzymes ont aussi une activité acyltransférase qui leur permet de transférer un acide gras sur un lysophospholipide et de former ainsi un phospholipide (Chen et al., 1997).

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1.2.4. Phospholipases C

Les PLC (EC 3.1.4.3) sont des phosphodiestérases qui catalysent l’hydrolyse de la partie proximale de la liaison phosphodiester des glycérophospholipides, permettant de générer du DG et un groupement polaire phosphorylé (Figure 4). On distingue deux types de PLC : les PC-PLC et les PI-PC-PLC.

Les PC-PLC, appelées aussi des PLC non spécifiques, hydrolysent une large gamme de substrats phospholipidiques mais ont une activité préférentielle d’hydrolyse de la PC. La structure 3D de la PLC de B. cereus montre que l’enzyme est constituée de sept hélices α formant un tonneau avec trois atomes de zinc (Zn²⁺) coordonnés au sein du site actif (Hough et al., 1989). Le résidu nucléophile du site actif est supposé fixer de façon covalente le groupement phosphate des phospholipides dans un mécanisme de type « ping-pong ». De plus la PC-PLC est une toxine importante chez de nombreux pathogènes ; elle est aussi impliquée dans de nombreux processus cellulaires chez les mammifères comme l’apoptose, la différentiation neuronale, l’activation du système immunitaire ou de facteurs de transcription (Aloulou et al., 2018).

Les PI-PLC sont des enzymes calcium-dépendantes qui appartiennent à une famille de treize membres classés en six catégories sur la base de leur séquence et de leur structure. On note cinq domaines conservés dans presque toutes les isoformes. Le domaine PH (plekstrin homology), le domaine EF-hand like, les domaines catalytiques X et Y et un domaine C2. Certaines isoformes possèdent en plus un domaine SRC homology ou Ras activation. Ces enzymes hydrolysent spécifiquement la liaison phosphodiester proximale du PI-4,5-P2. Elles permettent ainsi la libération du DG et de l’inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3). Le DG est un lipide neutre qui reste dans les membranes et active la PKC alors que l’IP3 est cytosolique et participe à la régulation du calcium intracellulaire.

1.2.5. Phospholipases D

Les PLD (EC 3.1.4.4) sont des phosphodiestérases qui catalysent l’hydrolyse de la partie distale de la liaison phosphodiester des glycérophospholipides, permettant de générer du PA et un groupement polaire soluble dans l’eau (Figure 4). Ces enzymes catalysent aussi une réaction de transphosphatidylation au cours de laquelle elles transfèrent le PA covalemment lié à l’enzyme sur un alcool primaire, générant ainsi un phosphatidylalcool (Figure 5).

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Figure 5 : Action catalytique d’hydrolyse et de transphosphatidylation de la PLD.

À l’instar des autres phospholipases décrites, la PLD a un rôle central dans les propriétés biochimiques des membranes biologiques par le second messager qu’elle génère (PA) et le remodelage membranaire que sa réaction de transphosphatidylation permet.

La phospholipase D appartient à la superfamille des PLD, une vaste famille de protéines dont la composition est discutable à partir du moment où elle regroupe des protéines aussi diverses dans leur fonction que dans leur structure.

Historiquement, les enzymes provoquant la libération de la choline ont été classées parmi les PLD et donc membres à part entière de la superfamille des PLD. Cette superfamille englobe des enzymes dont l'activité consiste à hydrolyser des liaisons phosphoesters telles qu'il en existe dans l'ADN ou les phospholipides membranaires. Ainsi, cette superfamille comprend des endonucléases comme Nuc qui hydrolyse de manière non spécifique les liaisons phosphoesters de l'ADN et est susceptible d'entretenir un rôle dans la conjugaison des bactéries. Elle comprend également BfiI, une enzyme de restriction qui hydrolyse de manière spécifique l'ADN sur un site non palindromique, et K4 une endonucléase virale d'orthopoxvirus qui faciliterait la condensation et le repliement du génome viral. La CL-synthase, une protéine à motif HKD, ou la PS-synthase qui catalysent les réactions de synthèse de CL et de PS par transphosphatidylation respectivement, appartiennent aussi à cette vaste superfamille. Enfin et surtout, cette superfamille comprend des phosphodiestérases comme les PLD.

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Avec les avancées technologiques de séquençage et de clonage, il apparaît que cette superfamille est composée de deux types de protéines dont la distinction majeure se situe dans leur motif catalytique qualifié de « HKD ». D’aucuns considèrent que les enzymes sans motifs HKD ne font pas partie de cette superfamille (Selvy et al., 2011), cela revient à exclure des enzymes aux fonctions identiques mais structuralement différentes alors que l’inclusion d’enzymes à motifs HKD permet la considération d’enzymes tout aussi éloignés des PLD en terme d’activité enzymatiques comme les nucléases.

Ces travaux de thèse se concentrent sur ce dernier type de PLD. Afin de caractériser au mieux la fonction et la structure des PLD, il est important de comprendre le cheminement scientifique de la recherche à ce sujet depuis la découverte des PLD.

1.3. État de la recherche sur la PLD