Activité catalytique des mutants

Le système d’expression P. pastoris ne maintient pas les plasmides libres mais les recombine au sein de son génome par recombinaison homologue au niveau du promoteur de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (pGAP) dans le cas du plasmide pGAPZB. Ainsi, chaque clone testé pour l’activité PLD est criblé par PCR au préalable pour vérifier l’insertion du transgène dans le génome de la levure.

Chaque mutant est ensuite testé dans les conditions décrites dans la partie Matériel & méthodes (cf. 2.2.4. Mesure de l’activité enzymatique). Un triplicat de clones indépendants est testé pour chaque construction et les résultats sont montrés dans la Figure 26. Le témoin positif est un clone de P. pastoris exprimant l’AtPLDα de type sauvage exprimé dans les mêmes conditions expérimentales et cultivé en parallèle des mutants testés. Le témoin négatif est un clone de P.

pastoris transformé par le vecteur pGAPZB vide (sans insert).

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Figure 26 : Mesure de l’activité catalytique des mutants de l’AtPLD et de leur expression.

A) L’activité spécifique relative est calculé avec 30 μg de protéines solubles extraites de P. pastoris exprimant ou bien la protéine sauvage (wt) dont la masse moléculaire est de 91,7 kDa, ou bien les mutants de l’enzyme ou transformée par le vecteur vide (Ct). L’activité relative est calculé par rapport au wt à 100 %. Toutes les activités enzymatiques sont testées sur trois clones indépendants (p<0.05 pour toutes les constructions par rapport au wt, sauf pour les mutants S348A et Q522A). B) Analyse par immunoempreinte de l’expression des différents mutants (en dessous de chaque profil d’activité). Un clone sur les trois choisi de façon aléatoire est analysé par SDS-PAGE suivi d’une immunoempreinte avec un anticorps anti domaine C2 d’AtPLDα. La flèche indique la masse moléculaire de la protéine wt.

3.1.1.3.1. Mutations des résidus catalytiques "HXKX

D"

Comme attendu et en accord avec les données de la littérature, les mutations des six résidus (2H, 2K, 2D) catalytiques abolissent complètement l’activité catalytique (Figure 26A) de l’enzyme, confirmant ici trois choses :

- Le système de criblage de l’activité catalytique à partir d’extrait brut de protéines solubles de P. pastoris utilisé dans ce travail est fiable et nous permet de discriminer la présence d’activité PLD (témoin positif, wt) ou son absence (vecteur vide, pGAP) (Figure 26A).

- Les résidus catalytiques mutés sont bien impliqués dans la catalyse.

- Les domaines HKD sont interdépendants et forment un seul site actif car la mutation d’un seul résidu des deux motifs abolit l’activité enzymatique (Figure 26A).

3.1.1.3.2. Motif "HHXKX

DX

S"

De façon plus inattendue, dans le motif HKD N-terminal, la mutation du doublet d’histidyl abolit l’activité enzymatique qu’il s’agisse de l’hystidyl catalytique H332 décrite dans la littérature ou de l’histidyl qui le précède H331 (Figure 26A). À l’inverse, la mutation du résidu

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séryl S348 situé en aval du motif HKD ne modifie pas l’activité catalytique (Figure 26A), signifiant qu’il n’est pas impliqué directement dans la catalyse.

3.1.1.3.3. Motif "YXHXKX

IXDDX

GSANXNX

RSM"

La mutation des résidus situés autour du motif HKD C-terminal abolit elle aussi l’activité catalytique de l’enzyme (Figure 26A). C’est le cas pour le tyrosyl Y659 avant le motif HKD mais aussi pour l’isoleucyl I666 situé au milieu de ce motif. Dans le doublet d’aspartyl D668 et D669 dont l’un est décrit comme catalytique, la mutation du second abolit aussi l’activité. De même tous les résidus mutés en aval abolissent l’activité. Notons que le S676A ne présente pas d’activité alors que son pendant dans le motif HKD N-terminal (S348A) est actif. Il est difficile d’imaginer que ces 14 résidus soient tous impliqués dans la catalyse. D’ailleurs, les structures existantes des motifs HKD des PLD bactériennes indiquent des aspartyls D339 et D668 catalytiques relativement éloignés de la poche catalytique formée par la partie HXK des deux motifs (Leiros et al., 2000). Ceci semble indiquer qu’ils ne sont pas impliqués directement dans la catalyse ni dans la stabilisation des résidus catalytiques mais potentiellement dans la stabilité structurale de l’enzyme ou bien dans l’interaction de celle-ci avec ses partenaires ou son substrat.

3.1.1.3.4. Motif "LLKKK", "PREPWHDIH", "FIYIENQYFKG"

et "FTVYVVV"

Sur le premier motif riche en lysyl, la mutation du K261A abolit l’activité et c’est aussi le cas pour tous les cinq mutants du motif "PREPWHDIH" (Figure 26A) : P401A, R402A, P404A, W405A et D407A. Notons ici que le mutant D407A dont on pense qu’il stabilise l’histidyl catalytique H661 ne possède pas d’activité. De la même façon, les mutations D689A et E691A dont on postule le même rôle n’ont pas d’activité.

Dans le motif "FIYIENQYFKG" la mutation du glutamyl central Q522 parfaitement conservée au cours de l’évolution (voir Figure 23) ne modifie pas ou très peu l’activité enzymatique (80

% de l’activité enzymatique du type sauvage). Inversement, la mutation du résidu aromatique F565 dans le domaine hydrophobe "FTVYVVV" abolit complètement l’activité enzymatique (Figure 26A).

Pour ce qui est des autres résidus en commun avec la PLD humaine (P771, G778, et G798), leur mutation abolit également l’activité enzymatique (Figure 26A).

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3.1.1.3.5. Motif "PPILTT"

La partie C-terminale des PLDα végétales est particulièrement bien conservée. Ainsi les quatre mutations du domaine "PPILTT" abolissent l’activité catalytique de l’enzyme (Figure 26A).

C’est le cas pour le P805A mais aussi, en accord avec la littérature, du threonyl terminal T810.

Quant au threonyl T809, jusque-là jamais étudié son remplacement par un alanyl (T809A) ou bien un seryl (T809S) abolit l’activité catalytique dans les deux cas, démontrant ainsi son importance dans ce domaine pour l’activité de l’enzyme (Figure 26A). Lors de l’étude de la PLD de chou par mutagenèse dirigée en 2006 (Lerchner et al., 2006), les auteurs montraient l’importance du dernier résidu T en construisant plusieurs mutants, en ajoutant un résidu S ou encore en retirant ce dernier résidu T. Toutes ces modifications entraînaient alors l’abolition totale de l’activité enzymatique, suggérant que ce peptide terminal serait enfoui dans la structure de la PLD.

3.1.1.3.6. Mutations aléatoires

Des six mutations aléatoires que nous avons obtenues R65G, A85S, P208S, A289V, P415T et M684V, une seule conserve de l’activité. Le mutant A289V présente environ 50 % de l’activité du type sauvage (Figure 26A). Ce résidu, situé dans une zone conservée et typique des PLD végétales "GLMATHD", est retrouvé dans 93 % des séquences de PLDα végétales et est parfois substitué par un résidu valyl comme chez le romarin (Rosmarinus officinalis).