Purification de la VuPLD

La purification de la VuPLD exprimée dans la levure P. pastoris est décrite dans la partie Matériel & méthodes (cf. 2.2.3. Purification de protéines). Cette méthode de purification spécifique aux PLD végétales décrite en 1992 (Lambrecht and Ulbrich-Hofmann, 1992) couple les phénomènes de chromatographie hydrophobe et d’affinité. En effet, on se sert de l’Octyl Sépharose^® comme d’une interface hydrophobe sur laquelle se fixent les PLD en présence de Ca²⁺. Cette fixation est résorbée par ajout d’EDTA qui, en chélatant les ions calcium, permet l’élution spécifique de la PLD (Figure 30). Cette méthode possède un avantage certain car elle ne présuppose pas de modification de l’enzyme comme l’ajout d’une étiquette ou d’une séquence spécifique pour la purification. Nous montrons au cours de ces travaux de thèse que la PLD végétale est très sensible aux mutations et aux modifications de séquences (cf. 3.1.1.

Mutagenèse dirigée de la PLD d’Arabidopsis thaliana et 3.2.2. Étude de la partie amino-terminale de la PLD d’Arabidopsis thaliana), notamment pour la stabilité de son activité enzymatique. Avec cette méthode qui permet de purifier une enzyme native, nous pouvons suivre l’avancée de la purification par l’activité catalytique.

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Figure 30 : Chromatogramme de purification de la VuPLD sur Octyl Sépharose^®.

L’absorbance UV à 280 nm est la courbe en bleu, la conductivité due au calcium est en rouge et le suivi de l’activité catalytique en μmol/min est en noir. L’ajout d’EDTA entraîne la chelation du calcium et l’élution de VuPLD.

Sur les 50 purifications (Tableau 5) effectuées durant cette thèse, nous purifions en moyenne 0,44 mg de protéine par 500 mL de culture avec un rendement moyen de 25 %.

161 Tableau 5 : Purifications de VuPLD

Les cellules grisées indiquent des données expérimentales incomplètes. mg : quantté de protéine purifiée en mg. Rdt : rendement.

Purification mg Rdt Utilisation Purification mg Rdt Utilisation

1 29

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Les purifications 29 et 41 n’ont pu être menées à terme pour des raison techniques ; les purifications 1 et 5 n’ont pas permis d’obtenir de protéines dans l’élution. Les purifications 30, 31 et 50 ont montré deux pics d’élutions séparés. Ce point sera discuté dans le chapitre 2 (cf.

3.2.2.1. État de l’art). Les purifications 2 à 6 ont été assemblées pour effectuer des expériences de SEC/MALS. Les purifications 7 à 11 ont été assemblées pour effectuer le premier criblage des conditions de cristallogenèse. Les purifications 12 à 19 ont été assemblées pour le second criblage autour des conditions fructueuses précédemment obtenues. Les purifications 20 à 28 ont été assemblées pour le troisième criblage. Les purifications 30 à 45 ont été assemblées pour le quatrième criblage, puis le cinquième criblage et les études de SAXS. Parmi celles-ci, le pic le plus abondant de la purification 31 a été utilisé pour le criblage d’inhibiteurs de la PLD qui sera développé au cours du chapitre 2 (cf. 3.2.3. Criblage, identification et caractérisation d’un nouvel inhibiteurs des PLDs). L’enzyme utilisée pour les étapes suivantes est dans un tampon Pipes 10 mM pH 6,2, EDTA 0,1 mM, NaCl 50 mM.

La suite de ces travaux a été réalisé en collaboration avec Laurent Terradot et Mickaël V. Cherrier au sein de l'équipe Biologie structurale des complexes macromoléculaires bactériens de l’Institut de Biologie et de Chimie des Protéines de Lyon (IBCP) puis en collaboration avec Mickaël V. Cherrier au sein de l’équipe Métallo-protéines de l’Institut de Biologie Structurale de Grenoble (IBS)

3.1.2.2.2. SEC/MALS

Cette méthode nous permet de donner une idée de le conformation quaternaire de la protéine en solution, et de connaître sa masse absolue et l’homogénéité en solution (cf. 2.3.1.

SEC/MALS) qui est un paramètre majeur en vue d’une cristallisation.

Nous analysons ici la protéine après deux étapes de purifications : une étape de chromatographie sur Octyl Sépharose^® et une étape de chromatographie d’exclusion.

163 Figure 31: Profil SEC/MALS de la VuPLD

A) Courbes non traitées, en rouge les mesure de la diffusion de lumière, en vert le rapport dn/dc et en noir l’absorbance UV à 280 nm. B) Chromatogramme de purification et analyse de la masse moléculaire en fonction du volume. Les points rouges représentent la répartition des masses calculées. La courbe noire représente l’évolution de l’absorbance à 280 nm.

Tout d’abord nous observons une importante diffusion de lumière en sortie de colonne pour un faible pic UV et un faible rapport dn/dc (Figure 31A). Le second pic de la Figure 31A est important en UV et en rapport dn/dc indiquant qu’il s’agit bien d’un pic de protéine. Le troisième pic est faible en UV et en diffusion de lumière ; à ce stade l’échantillon est très peu concentré ce qui explique le rapport important dn/dc.

Après traitement (Figure 31B), il apparaît que le pic initial à 1 mL est un agrégat d’origine inconnue dont la taille plus importante en solution diffuse beaucoup de lumière mais

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l’absorption UV à 280 nm indique qu’il ne s’agit pas de protéines. On observe un pic minime à 1,4 mL puis un pic majeur à 1,7 mL qui correspond à VuPLD. Un dernier pic minime apparaît à 2,5 mL mais l’importance du pic dn/dc (Figure 31A) témoigne de la faible quantité de protéines.

Au cours de cette expérience la masse moléculaire mesurée de VuPLD est de 115 kDa. Cette masse est plus importante que la masse théorique de 91,5 kDa. Plusieurs facteurs expliquent cela. Tout d’abord, même après une chromatographie d’exclusion des contaminants demeurent et peuvent influencer la lecture de la masse moléculaire de la protéine en solution. De fait, selon la qualité de la chromatographie, des contaminants de masse moléculaire proche de celle de la PLD pourront ne pas être exclus. Ensuite, on sait que les PLD végétales subissent des modifications post-traductionnelles, des glycosylations pouvant affecter la masse théorique de l’enzyme (Ben Ali et al., 2007). Enfin, le SEC/MALS est calibré au préalable avec de la BSA qui est une protéine globulaire. Cela peut introduire un biais si d’aventure la PLD possède une structure et des proportions radicalement différentes.

L’une des informations majeures que nous apporte cette expérience de SEC/MALS est la présence d’un pic unique de VuPLD témoignant d’une part de son homogénéité en solution et d’autre part de sa propension à rester monomérique et à ne pas dimériser en solution concentrée.

Ce facteur est particulièrement important pour mener à bien un criblage de cristallogenèse dans lequel la protéine doit être concentrée et homogène en solution.