Chapitre 3 : Modèles DFR-LAR et "Substrate channeling"
III) Simulations de dynamique moléculaire des complexes DFR-LAR
III.4) Rôle de la solvatation dans le phénomène de "substrate channeling"
Les métabolons sont des assemblages transitoires d'enzymes, ce qui implique une proximité des différentes cavités. Ils
concentrant les intermédiaires réactionnels
avons observé le transfert du substrat d'un site actif à l'autre sans passer par une phase de diffusion dans une phase purement solvant. Ce processus peut être considéré comme un phénomène de "substrate channeling". Le rôle de la solvatation est ici crucial. Une analys la micro-solvatation du substrat au cours de la simulation réactive a été réalisée.
Le nombre de molécules d'eau dans la première sphère distance de 3,4 Å du ligand) a donc été mesuré. La
ensembles de 600 ps, et pour chaque ensemble, une valeur moyenne et un écart type du nombre de molécules d'eau ont été calculés. Une simulation de DM de la LCC dans une phase purement solvant a été réalisée pour estimer le nombre moyen de molécules d présentes dans la première sphère de solvatation. La solvatation maximale a été évaluée à environ 36 molécules d'eau.
Figure 69 : Evolution du nombre de molécule du site actif de DFR vers celui de LAR
solvant). En rouge est représentée l'évolution, et en noire les barres d'erreurs associées. La ligne rouge montre le nombre moyen de molécules d'eau pour un substrat complèteme
LAR et "Substrate channeling"
Rôle de la solvatation dans le phénomène de "substrate
t des assemblages transitoires d'enzymes, ce qui implique une proximité des différentes cavités. Ils maintiennent et accroissent le flux métabolique
intermédiaires réactionnels dans l'environnement proche des enzyme
le transfert du substrat d'un site actif à l'autre sans passer par une phase de diffusion dans une phase purement solvant. Ce processus peut être considéré comme un phénomène de "substrate channeling". Le rôle de la solvatation est ici crucial. Une analys
solvatation du substrat au cours de la simulation réactive a été réalisée.
Le nombre de molécules d'eau dans la première sphère de solvatation
distance de 3,4 Å du ligand) a donc été mesuré. La simulation a été découpée en 157 00 ps, et pour chaque ensemble, une valeur moyenne et un écart type du nombre de molécules d'eau ont été calculés. Une simulation de DM de la LCC dans une phase purement solvant a été réalisée pour estimer le nombre moyen de molécules d présentes dans la première sphère de solvatation. La solvatation maximale a été évaluée à
: Evolution du nombre de molécules d'eau autour du substrat lors de sa diffusion e DFR vers celui de LAR (sphère de solvatation prise entre 1 et 3,4 Å autour du En rouge est représentée l'évolution, et en noire les barres d'erreurs associées. La ligne rouge montre le nombre moyen de molécules d'eau pour un substrat complèteme
solvaté.
Rôle de la solvatation dans le phénomène de "substrate
t des assemblages transitoires d'enzymes, ce qui implique une maintiennent et accroissent le flux métabolique en l'environnement proche des enzymes. Nous le transfert du substrat d'un site actif à l'autre sans passer par une phase de diffusion dans une phase purement solvant. Ce processus peut être considéré comme un phénomène de "substrate channeling". Le rôle de la solvatation est ici crucial. Une analyse de
solvatation du substrat au cours de la simulation réactive a été réalisée.
de solvatation (jusqu'à une simulation a été découpée en 157 sous- 00 ps, et pour chaque ensemble, une valeur moyenne et un écart type du nombre de molécules d'eau ont été calculés. Une simulation de DM de la LCC dans une phase purement solvant a été réalisée pour estimer le nombre moyen de molécules d'eau présentes dans la première sphère de solvatation. La solvatation maximale a été évaluée à
d'eau autour du substrat lors de sa diffusion (sphère de solvatation prise entre 1 et 3,4 Å autour du En rouge est représentée l'évolution, et en noire les barres d'erreurs associées. La ligne rouge montre le nombre moyen de molécules d'eau pour un substrat complètement
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149 Nous remarquons que cette courbe présente de nombreuses similarités avec la courbe de l'évolution de l'énergie d'interaction LCC/complexe calculée par le protocole MM-GBSA. Le profil peut être découpé en trois étapes, de la même manière que précédemment. Ainsi, chaque barrière d'énergie peut être associée à une solvatation partielle du substrat, plus ou moins importante selon la valeur de la barrière. Les minimums de micro-solvatation sont ainsi associés à des interactions plus importantes avec l'enzyme. Enfin, nous pouvons remarquer que nous n'obtenons jamais une solvatation totale de la molécule lors du transfert vers la seconde enzyme. Le nombre de molécules d'eau entourant le métabolite (valeur max égale à 28 molécules d'eau) est toujours inférieur à la valeur estimée dans la simulation de LCC dans une phase solvant pure (estimée à 36 molécules d'eau).
Les effets de solvant jouent un rôle majeur dans le processus d'interaction ligand/récepteurs. Ici, lors du transfert de la molécule d'une enzyme à une autre, un phénomène de solvatation/désolvatation a lieu. La libération du substrat entraîne une solvatation partielle de celui-ci grâce à l'existence du complexe DFR-LAR. Le processus de désolvatation lié à l'association LAR-substrat est moins pénalisant d'un point de vue énergétique lors de la formation d'un tel édifice. Le transfert de LCC de DFR vers LAR a lieu lors de la première étape (0-300 ns) et le nombre de molécules d'eau autour du substrat est ici de 28 au maximum. Le gain sur la pénalité de désolvatation est donc d'environ 20% (28/36). La valeur de l'énergie de solvatation calculée par le protocole MM-GBSA est de 59,39 kcal/mol. Le gain d'énergie sur la pénalité de désolvatation est donc de l'ordre de 12 kcal/mol.
La formation de ces complexes multienzymatiques permet donc un transfert de molécules d'un site actif à l'autre, et permet à celle-ci de ne pas être resolvater de manière totale, entraînant un gain d'énergie non négligeable. Ce phénomène de solvatation partielle est ainsi une des forces motrices du phénomène de "substrate channeling", qui est la base même du fonctionnement d'un métabolon.
IV)
Conclusion
Un métabolon est un assemblage complexe d'enzymes, ce qui rend ce type de structure difficile à étudier expérimentalement. Ainsi, les outils de modélisation moléculaire sont précieux et parfaitement adaptés pour une analyse moléculaire de ce type de complexe. Les différents protocoles (RAMD, DM, Docking protéine-protéine, aMD) utilisés ont permis d'étudier de manière pertinente ce type de structure. Ils nous ont permis de répondre à différentes problématiques associées : i) l'identification des voies d'accès au site actif des deux
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enzymes pour les métabolites ii) un modèle d'interaction pertinent entre les deux enzymes, dans lequel une connexion existe entre les deux sites actifs et iii) l'étude des phénomènes dynamiques associés à ce type de structure à une résolution atomique.
Dans le cadre de la biosynthèse des flavonoïdes, la voie métabolique fait intervenir l'une à la suite de l'autre les enzymes DFR et LAR. La formation d'un complexe entre ces deux enzymes est donc envisageable. Dans ce chapitre, nous avons étudié la possible association de ces deux enzymes et fourni des informations au niveau moléculaire et énergétique sur les phénomènes associés à ce complexe multienzymatique. La détection des entrées/sorties des deux enzymes ont permis de faciliter l'identification des complexes pouvant présenter une connexion entre les sites actifs enzymatiques. Les calculs de docking permettent de dégager deux structures, dont l'une présente une interaction classique de type protéine-protéine transitoire. Les simulations de dynamique moléculaire, appliquées sur ces deux structures, montre généralement une libération de la leucyanidine du site actif de DFR, dans des temps plus courts que lorsque le complexe DFR-NADP+-LCC est considéré seul. Nous avons réussi à échantillonner dans le cas du complexe S2, un transfert du LCC du site actif de DFR vers celui de LAR, sans appliquer aucune contrainte. Cette observation peut être assimilée à un phénomène de "substrate channeling".
Ce phénomène montre un ∆∆E total de transfert de -8 kcal/mol. Plusieurs étapes ont pu être identifiées avec tout d'abord, une libération de LCC à partir de la cavité de DFR pour une migration vers l'interface protéine-protéine, ensuite une exploration de la surface de l'enzyme LAR par le métabolite. Enfin, l'étape finale consiste en l'entrée du ligand dans le site actif de la seconde enzyme. Le long de ce phénomène, la solvatation joue un rôle majeur. En effet, le substrat n'est jamais resolvaté de manière complète, on observe ainsi un gain non négligeable sur les pénalités de désolvatation, ce qui facilite ainsi le transfert de la molécule, et de limiter la déstabilisation de l'interaction complexe/ligand, comme par exemple celles associées à une entrée ou sortie de cavité. Ainsi, la solvatation partielle du substrat joue un rôle crucial dans le phénomène de "substrate channeling" et dans le fonctionnement d'un métabolon.
Les différents résultats reliés au phénomène de "substrate channeling" ont été observés sur la base d'une seule simulation, ce qui ne nous permet pas de dégager, en premier abord, une statistique suffisante. L'idéal aurait été d'effectuer plus de calculs sur ces complexes afin d'échantillonner une seconde fois le processus. Nous ne devons cependant pas oublier que ce
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151 type de phénomène est associé à des temps de simulation de l'ordre de la microseconde, ce qui demande de grandes ressources de calcul. De plus, l'échantillonnage de conformations hautes en énergie sur ces systèmes très hydrophiles est plus difficile que sur des systèmes totalement hydrophobes (par exemple, les RCPG), car il est nécessaire de rompre des interactions plus fortes, comme des interactions de type liaison hydrogène.