DHQ (Dihydroquercétine)

Sur le profil réactif de nos deux substrats, nous observons une première montée en énergie amenant à une structure d'énergie environ égale à 6-7 kcal/mol par rapport aux réactifs (voir Figure 39, cercle rouge). Ce point apparaît lors de la première phase du chemin réactionnel, qui n’est dépendant que de la contrainte liée au transfert d’hydrure. Toutefois, un point attire l’attention. En effet, si nous décomposons, dans le cas du DHQ, la contrainte selon les deux distances qu'elle implique (distance H-DHQ et H-NADPH), il apparaît que seule la distance hydrure-DHQ voit sa valeur se modifier dans cette partie. En revanche, la distance H-NADPH n’est que très peu modifiée (voir Figure 49).

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Figure 49 : Représentation de l'évolution des distances composant la contrainte du transfert d'hydrure durant la réaction. Le trait noir marque la fin de la première montée en énergie

observée.

Cette étape caractérise donc un rapprochement des réactifs, (cofacteur NADPH et substrat DHQ) et il ne peut être considéré que le transfert d’hydrure ai déjà commencé. Les états échantillonnés lors de cette phase du mécanisme sont donc des conformations qui seront plus proches de la structure de l'état de transition. Ceci correspond à la définition des structures classées en tant que NAC. La distance hydrure-DHQ peut être considérée comme un critère structural principal pour la caractérisation de conformation de type NAC. La plupart du temps, les distances et angles d'attaque sont retenus pour la caractérisation des NAC [159]. Ici, l'angle de pyramidalisation de l'atome de carbone du substrat impliqué dans la réaction peut être également choisi comme critère, car l'hybridation de l'atome passe d'un sp2 à un sp3. La variation de l'angle de pyramidalisation de l'atome de carbone est représenté sur la Figure 50.

Figure 50 : Evolution de l'angle de pyramidalisation du carbonyle le long du chemin réactionnel

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L'analyse du profil réactionnel concernant DHQ montre que l'angle de pyramidalisation de l'atome de carbone impliqué dans la réaction varie très peu lors de la phase de rapprochement des entités réactives. Nous pouvons remarquer toutefois que le carbone n'est pas totalement plan et présente une pyramidalisation légère. Lorsque les réactifs sont en contact, et ce même avant que la réaction en elle-même débute, la pyramidalisation de l'atome devient plus importante. Cela montre que cette première phase de rapprochement permet au final d'obtenir un complexe "préparé" à la réaction, avec un atome de carbone partiellement hybridé sp3 (valeur de l'angle à environ -20°).

Concernant les valeurs de la distance hydrure-carbonyle et de l'angle de pyramidalisation pour les réactifs, leur valeur moyenne est respectivement de 2,48 Å et de -1,44° dans la fenêtre de calcul [-1.35;-0.75]. Nous pouvons comparer ainsi ces valeurs avec ce que nous observons lors de simulations de dynamique moléculaire "brute-force" de type QM/MM. L'analyse de ces simulations non biaisées montre que :

Concernant la distance hydrure-carbonyle, la distance moyenne obtenue sur des simulations longues de plus de 1 ns est de l'ordre de 2,67 Å, ce qui est légèrement au dessus de la distance moyenne de l'état initial. Nous pouvons par contre noter que nous échantillonnons des états dans lesquels la distance est en deçà de la valeur moyenne (valeur minimale 1,91 Å). D'après les analyses, 28% des structures échantillonnées durant la simulation sont en dessous de cette valeur.

Pour la pyramidalisation de l'atome de carbone subissant la réduction, la valeur moyenne est de -2,76°. Cela correspond à une valeur déjà inférieure (l'atome de carbone est plus pyramidalisé) à celle rencontrée lors de notre simulation des réactifs de la réaction. La valeur maximale obtenue pour cet angle est de -16°. La Figure 51 représente la distribution des valeurs des critères de définition d'un NAC échantillonnées durant la simulation non biaisée.

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Figure 51 : Distribution des valeurs échantillonnées durant la simulation DM-QM/MM pour l'angle de pyramidalistaion (à gauche) et la distance hydrure-DHQ (à droite).

L'échantillonnage de valeur de la pyramidalisation de l'atome de carbone impliqué dans la réaction laisse supposer que malgré l’implication de cet atome de carbone dans un cycle conjugué, les différents mouvement de l’enzyme sont susceptibles de « préparer » cet atome à une modification de son hybridation. De plus, notons que lors de l'étape de rapprochement, la pyramidalisation de l'atome reste très faible (valeur maximale -10°) alors que la distance entre le cofacteur et le substrat diminue fortement. Afin d’estimer ce que coûte ce processus de début de pyramidalisation, nous avons réalisé un scan de l’énergie en fonction de l'angle dièdre au niveau QM B3LYP/6-31+G*. Il s'avère que le changement d'hybridation (de 0° à -15 °) ne coûte que très peu d'énergie, environ 1,9 kcal/mol, ce qui rend cette transition très facilement réalisable à température ambiante. Ainsi, le processus de pyramidalisation ne devrait pas être un frein à l’obtention de structure de type NAC. Pour la suite, seule la distance hydrure-DHQ est retenue pour la recherche de conformations que l’on peut considérer comme pré-réactives, i.e. pour lesquelles le rapprochement est effectif, ou tout du moins bien avancé. Nous considérerons également en contrainte supplémentaire (mais pas comme un critère structural nécessaire) que la contrainte représentant le transfert de proton se situe dans l'intervalle que nous avons défini sur notre surface d'énergie potentielle (Valeur max : -0.90 Å)

Sur toute la simulation (générant 10000 structures différentes), les points pouvant êtres associées à des structures de type NAC ont été estimés à un nombre de 1000, soit 10 %. Nous pouvons donc projeter les points échantillonnés en simulation de DM QM/MM les plus pertinents sur notre profil réactionnel afin d'estimer l'énergie gagnée sur la barrière totale. Les points sont représentés sur la Figure 52.

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Figure 52 : projection des points échantillon

réactionnel de DHQ. Ne sont représentés que les points représentatifs de tous les états observés. L'étoile rouge représente le point décrivant l'état initial de la réaction.

Le point le plus élevé est identifié à une position [ énergie d'environ 3,5 kcal/mol

mouvements de l'enzyme sont

qui permet de réduire la barrière d'activation totale de 3,5 kca

pas échantillonné dans nos simulations de dynamique moléculaire QM/MM, nous pouvons assumer, au vu des résultats obtenus, que l'enzyme doit être capable de produire un complexe pré-réactif correspondant à l'état intermédiaire

réactifs est maximal (position [

diminution non négligeable de la barrière réactionnelle totale. Nous pouvons donc dire que l'enzyme catalyse la réaction et