Interactions entre les différents substrats et l'enzyme calculs US-DM QM/MM à

III.1)

Simulation sans contraintes DM classique et hybrides

QM/MM

Pour chacun des deux systèmes, complexes enzyme-NADPH-DHQ et enzyme- NADPH-DHK, 5 simulations de DM classique, d'une durée de 20 ns, ont été réalisées afin de vérifier leur stabilité. Les RMSd calculées sur les évolutions structurales de l'enzyme le long des trajectoires montrent que dans chaque cas, la structure générale reste cohérente lors des différentes simulations. De manière générale, le RMSd de l'enzyme reste inférieur à 2,5 Å. En cohérence avec les analyses effectuées sur la structure cristallographique, les simulations du complexe ternaire montrent que les résidus Asn 133 (deux interactions dans le cas du DHQ, une pour DHK) et Glu 227 interagissent de manière forte avec les groupements hydroxyles du cycle B du substrat et peuvent, de ce fait, être considérés comme des résidus de reconnaissance. D'autres acides-aminés, faisant partie de la triade catalytique, sont impliqués dans des interactions par liaison hydrogène : la tyrosine 163 et la sérine 128. A un moindre niveau, car faisant intervenir une molécule d’eau pontante, la thréonine 191, ainsi qu'un des atomes d'oxygène du groupement diphosphate du cofacteur, interagissent avec un groupement hydroxyle du cycle C. Un grand nombre de résidus de la cavité est impliqué dans des interactions de type hydrophobes avec le substrat. Nous pouvons particulièrement noter

Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR

l'isoleucine 222 et la valine 193, qui interactions de type σ-π.

Afin d’équilibrer et préparer nos systèmes dans le cadre simulations de type DM-QM/MM

ns et une de 2 ns pour le complexe ternaire avec DHQ, 2 simulations de 1ns pour le complexe DHK-enzyme, soit un total resp

des simulations classiques sont retrouvé valeurs légèrement différentes

substrat). Les interactions de type liaison hydrogène sont de 1,8-1,6 Å. Nous pouvons noter que la seule différence nota et celle du DHK est l'absence d

l'absence d'un groupement hydroxyle sur le cycle B

manière détaillée les interactions stabilisantes de la dihydroquercétine avec la DFR. arrangement spatial est compatible avec la réaction telle qu’elle est anticipée.

représente ainsi la structure de départ ch

Figure 37 : Représentations des différentes interactions du substrat dans le site actif. L'interaction entre l'asparagine

dihy

Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR

l'isoleucine 222 et la valine 193, qui sont en contact avec les cycles aromatiques par

nos systèmes dans le cadre de l'étude de la réactivité, QM/MM ont été réalisées d'une durée de 1 à 2 ns :

de 2 ns pour le complexe ternaire avec DHQ, 2 simulations de 1ns pour le complexe , soit un total respectif de 4 et 2 ns simulées. Les interactions relevées

es simulations classiques sont retrouvées dans les calculs hybrides, avec cepen

différentes (par exemple, la thréonine 191 interagit directement avec le es interactions de type liaison hydrogène sont notamment plus courtes, de l'ordre 1,6 Å. Nous pouvons noter que la seule différence notable entre l'interaction du DHQ et celle du DHK est l'absence d'une liaison hydrogène avec l'asparagine

l'absence d'un groupement hydroxyle sur le cycle B du DHK. La Figure

illée les interactions stabilisantes de la dihydroquercétine avec la DFR. arrangement spatial est compatible avec la réaction telle qu’elle est anticipée.

représente ainsi la structure de départ choisie pour commencer l’étude de réactivité.

: Représentations des différentes interactions du substrat dans le site actif. 'interaction entre l'asparagine et la dihydroquercétine, qui n'existe pas dans le cas du

dihydrokaempferol, est entourée en rouge.

avec les cycles aromatiques par

de l'étude de la réactivité, plusieurs : 2 simulations de 1 de 2 ns pour le complexe ternaire avec DHQ, 2 simulations de 1ns pour le complexe Les interactions relevées le long s dans les calculs hybrides, avec cependant des (par exemple, la thréonine 191 interagit directement avec le plus courtes, de l'ordre ble entre l'interaction du DHQ 'une liaison hydrogène avec l'asparagine 133 provenant de Figure 37 représente de illée les interactions stabilisantes de la dihydroquercétine avec la DFR. Cet arrangement spatial est compatible avec la réaction telle qu’elle est anticipée. La Figure 37

de réactivité.

: Représentations des différentes interactions du substrat dans le site actif. et la dihydroquercétine, qui n'existe pas dans le cas du

Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR

103

III.2)

Calculs DM-QM/MM US à une dimension

Dans un premier temps, des premiers calculs de DM-QM/MM couplés avec le protocole d'Umbrella Sampling ont été effectués avec une seule coordonnée de réaction représentant uniquement le transfert d'hydrure. La simulation, d'une durée totale de 735 ps (21 fenêtres de 35ps), a permis l'obtention d’un potentiel de force moyenne associé à la réaction de transfert. Ce profil est représenté sur la Figure 38.

Ce potentiel présente trois phases distinctes :

de -1,80 à 0,5 Å : l'énergie varie de 0 à 6 kcal/mol. Cette phase correspond exclusivement à un rapprochement du NADPH et du substrat. En effet, durant cette phase, et malgré l’application de la contrainte, la distance CNADPH-H n’évolue pas. L'état obtenu à la fin de ce rapprochement est donc un état intermédiaire idéal pour le transfert d'hydrure.

Figure 38 : Potentiel de force moyenne obtenu pour le transfert d'hydrure.

de -0,5 à 0,2 Å : l'énergie varie de 6 à 12 kcal/mol. Cette phase correspond au transfert d'hydrure. L'état de transition du transfert d'hydrure a été ainsi identifié pour une valeur de 0,2 Å de la coordonnée, ce qui correspond à des distances CNADPH-H = 1,43 Å et H-CDHQ = 1,22 Å.

de 0,2 à 0,8 Å : l'énergie varie de 12 à 7,5 kcal/mol. Cette phase correspond à la relaxation provoquée par le franchissement de l'état de transition. La cascade de transferts de protons ne s'effectue qu'après le transfert d'hydrure. Nous pouvons

Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR

remarquer que les produits de réactions possèdent une énergie plus élevée que les réactifs. Nous pouvons supposer que cela provient du fait que la lysine167 n'est pas reprotonée en fin de réaction lors de notre simulation.

En effectuant un calcul QM au niveau B3LYP/6-31++G** de la reprotonation par un ion oxonium d'une lysine déprotonnée, l'enthalpie libre de Gibbs associée est de l'ordre de -12 kcal/mol. Cela permet d’estimer que l’état final de notre réaction pourrait atteindre une énergie relative de - 6kcal/mol par rapport aux réactifs. Dans le cas du DHK, un comportement similaire a été observé, avec cependant une barrière d'activation plus élevée (état de transition à 16 kcal/mol).

Comme nous venons de le voir, cette campagne de simulations biaisées du transfert d’hydrure entraîne la cascade de transferts de protons dans son intégralité. Afin de vérifier si le transfert du premier proton (biais CR2) entraînerait le transfert d’hydrure, une campagne de calculs simulant le transfert de proton de la tyrosine vers le substrat a été réalisée suivant le même protocole. Une barrière très élevée (18 kcal/mol) est relevée sur le profil énergétique. La simulation conduit à un intermédiaire très faiblement stabilisé par rapport à l’état de transition (17 kcal/mol). Dans cette structure, le transfert de proton est effectif mais n’induit ni le transfert des autres protons, ni le transfert d'hydrure. Il apparaît donc que la première simulation devrait nous permettre de caractériser l’état de transition de la réaction biochimique.

Afin de le vérifier, nous avons réalisé une nouvelle simulation de DM-QM/MM biaisée, pour laquelle est appliqué le biais correspondant à la fenêtre encadrant l’état de transition. Cette valeur correspond à un biais de CR1 = 0,2 Å. L'idée étant que si nous sommes exactement sur cet état de transition, chaque système soumis à des simulations de dynamique moléculaire à partir de cette position devrait se relaxer de manière aléatoire vers les produits ou les réactifs de la réaction. Une simulation longue (2 ns), sous contrainte, a été effectuée et certaines structures ont été choisies le long de cette trajectoire comme point de départ pour des simulations sans contrainte. 100% de ces simulations (environ 30 calculs différents) présentent un retour vers les réactifs uniquement. De plus, lors de l'analyse de la trajectoire sous contrainte, il apparaît que la tyrosine présente un comportement particulier. En effet, le proton se transfère de manière naturelle vers le substrat mais revient également auprès de l'atome d'oxygène de la tyrosine, et ceci de manière spontanée. De ces analyses, il apparaît qu'il existe un couplage entre la

Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR

105 coordonnée représentant le transfert d'hydrure et la coordonnée de réaction associée au transfert de proton. Par conséquent, les calculs basés sur l’utilisation d’une contrainte ne peuvent pas être suffisant pour décrire correctement le mécanisme. Nous devons ainsi réaliser des simulations plus élaborées basées sur la définition de deux biais.