Paramètres du champ de force

II.1)Représentation des enzymes

Le champ de force ff03.r1 [111,112] de la suite AMBER a été utilisé pour modéliser les atomes de nos différentes enzymes. Afin de reproduire les conditions biologiques, les différents résidus des trois protéines ont été protonés au pH 6,5 grâce au serveur H++ [133]. Un résumé des différents états de protonation des résidus d'intérêts (c'est-à-dire ceux impliqués dans les interactions entre la protéines et les différents partenaires biologiques, et ceux impliqués dans les réactions enzymatiques) pour chaque enzyme est présenté dans le Tableau 1.

On pourra noter dans le cas de LAR que la lysine catalytique, identifiée comme étant K140 par l'expérience, est considérée comme étant protonée à ce pH et possède un pKa encore très élevé. Ce résultat va à l'encontre des observations de Mauge et al. qui basait le mécanisme enzymatique de LAR sur une lysine catalytique déprotonée qui initierait la réaction. Les contre-ions ont été rajoutés pour garantir la neutralité électronique du milieu (DFR : 10 contre-ions Na+; LAR : 8 contre-ions Na+; F3'H : 7 contre-ions Cl-). Chacun de ces systèmes a été ensuite placé dans une boîte de solvant avec conditions périodiques et avec une distance minimale du placement du solvant autour du soluté de 8 Angströms.

Chapitre 1 : Préparation des systèmes

DFR LAR

K39 (Lysine protonée) K140 (Lysine protonée)

K167 (Lysine protonée) H122 (Histidine protonée en δ)

H244 (Histidine protonée en ε) H172 (Histidine doublement protonée)

/ E94 (Glutamate déprotoné)

/ D98 (Aspartate déprotoné)

/ K50 (Lysine protonée)

Tableau 1 : Etat de protonation de résidus d'intérêts au sein des enzymes DFR et LAR. F3'H possédant un site actif très hydrophobe, il ne présente pas de résidus titrables.

II.2)Représentation des partenaires biologiques

II.2.a)

Cofacteurs

En ce qui concerne le cofacteur NADPH et son état oxydé NADP+, les paramètres ont été repris de l'étude de Ryde et al.[134, 135] et sont utilisés dans les simulations impliquant DFR et LAR.

Le groupement hème est un cofacteur dans les cytochromes P450. De nombreuses études et de nombreux paramètres ont été publiés[136, 137], mais une publication récente de Shahrokh et al.[138] met en lumière l'importance de la cystéine coordinante dans l'interaction globale de l'hème avec F3'H. De nouveaux paramètres ont donc été calculés de manière spécifique pour cette cystéine et pour le groupement hème impliquant différents états d'oxydation de l'atome métallique. Ici, ces paramètres ont donc été choisis pour un état d'oxydation II de l'atome de fer (état initial avant réaction).

II.2.b)Substrat

Dans ces différentes études, nous avons choisi de considérer trois substrats différents : DHQ (produit de F3'H et substrat de DFR), DHK (substrat de F3'H, mais également de DFR), et LCC (produit de DFR et substrat de LAR). Les paramètres de ces différentes molécules ont été assignés depuis le champ de force GAFF (Général Amber Force Field[139]). Les charges ont été obtenues à partir de calculs de chimie quantique avec le logiciel Gaussian03[140] au

niveau de théorie HF/6-31G*. Le logiciel Antechamber a ensu charges de type RESP sur chaque atome de nos substrats.

Dans le cas particulier de F3'H, dont la structure est issue d'une reconstruction homologie, le placement du

connus et nécessite alors l'utilisation de méthodes de docking pour pouvoir prédire leur position. Autodock Vina[141

(DHK) et du produit (DHQ). La grille a été définie au centre de l'enzyme et est de dimension 16,5x15x16,5 Å3, ce qui permet de limiter l'espace de recherche d'interactions. Une seule position du DHK a été retenue pour la réalisation des simulations de dynamique moléculaire. En effet, les autres solutions proposées par le logiciel n'étaient pas cohérentes avec le mécanisme de l'enzyme, qui consiste en une oxydation du cycle B, par addition d'un groupement hydroxyle[142,

compatible avec le mécanisme enzymatique envisagé

Figure 32 : Pose du dihydrokaempferol retenue pour les simulations de dynamiq

Concernant DHQ, une seule position a été retenue pour les équivalente à la pose du DHK.

II.3)Préparation des systèmes avec membrane

Dans le cadre de l'étude du métabolon, la description des interactions entre enzyme et la membrane est cruciale, plus particulièrement pour F3'H qui joue le rôle d'anc

membrane. Il est donc indispensable de pouvoir prédire correctement les interactions entre

Chapitre 1 : Prépara

31G*. Le logiciel Antechamber a ensuite été utilisé pour calculer les charges de type RESP sur chaque atome de nos substrats.

Dans le cas particulier de F3'H, dont la structure est issue d'une reconstruction cofacteur et du substrat à l'intérieur de la cavité

et nécessite alors l'utilisation de méthodes de docking pour pouvoir prédire leur 141] a été utilisé pour réaliser le calcul de docking du substrat (DHK) et du produit (DHQ). La grille a été définie au centre de l'enzyme et est de dimension , ce qui permet de limiter l'espace de recherche d'interactions. Une seule été retenue pour la réalisation des simulations de dynamique moléculaire. En effet, les autres solutions proposées par le logiciel n'étaient pas cohérentes avec le mécanisme de l'enzyme, qui consiste en une oxydation du cycle B, par addition d'un

, 143]. Seule la position, représentée sur la compatible avec le mécanisme enzymatique envisagé.

du dihydrokaempferol retenue pour les simulations de dynamiq moléculaire de F3'H.

DHQ, une seule position a été retenue pour les du DHK.

Préparation des systèmes avec membrane

Dans le cadre de l'étude du métabolon, la description des interactions entre enzyme et la membrane est cruciale, plus particulièrement pour F3'H qui joue le rôle d'anc

membrane. Il est donc indispensable de pouvoir prédire correctement les interactions entre

Chapitre 1 : Préparation des systèmes

89 ite été utilisé pour calculer les

Dans le cas particulier de F3'H, dont la structure est issue d'une reconstruction par à l'intérieur de la cavité ne sont pas et nécessite alors l'utilisation de méthodes de docking pour pouvoir prédire leur utilisé pour réaliser le calcul de docking du substrat (DHK) et du produit (DHQ). La grille a été définie au centre de l'enzyme et est de dimension , ce qui permet de limiter l'espace de recherche d'interactions. Une seule été retenue pour la réalisation des simulations de dynamique moléculaire. En effet, les autres solutions proposées par le logiciel n'étaient pas cohérentes avec le mécanisme de l'enzyme, qui consiste en une oxydation du cycle B, par addition d'un . Seule la position, représentée sur la Figure 32, était

du dihydrokaempferol retenue pour les simulations de dynamique

DHQ, une seule position a été retenue pour les simulations et est

Dans le cadre de l'étude du métabolon, la description des interactions entre enzyme et la membrane est cruciale, plus particulièrement pour F3'H qui joue le rôle d'ancre à la membrane. Il est donc indispensable de pouvoir prédire correctement les interactions entre

Chapitre 1 : Préparation des systèmes

F3'H et la membrane, via son hélice transmembranaire uniquement ou également par une interaction de surface. Pour obtenir une première estimation de cette in

de F3'H a été soumise à l'analyse du serveur OPM, qui permet de prédire les interactions entre protéines et membrane par comparaison avec une base de données préexistante.

Les 25 acides aminés structurés en hélice alpha, dans la p

prédis comme étant transmembranaires. L'angle de "tilt" de l'hélice par rapport à la surface de la membrane est de 30°. Au delà de cette caractérisation, qui confirme les données expérimentales sur les cytochromes P450, d'autres

comme interagissant à la surface de la membrane. Ces derniers sont pour la plupart hydrophobes (tryptophane 226, alanine 223, proline 222, isoleucine 37, proline 36, phénylalanine 69). Afin de vérifier si cette prédic

l'hélice transmembranaire, nous avons décidé de prédire l'interaction avec la membrane de F3'H en enlevant la partie N

aminés sont retrouvés en inter

d'interaction F3'H/membrane. Les différentes portions impliquées dans l'interaction sont donc l'hélice transmembranaire, jouant le rôle d'ancre membranaire, ainsi les résidus 222

37 et 69, interagissant à la surface. Ces derniers peuvent empêcher des mouvements trop importants de l'enzyme lorsque cette dernière est liée. L'interaction est représentée sur la Figure 33.

Figure 33 : à gauche, représentation de l'interaction F3'H/membra OPM. A droite, détail de l'interaction de surface et des

En se basant sur ce positionnement, le logiciel Maestro été utilisé pour placer la membrane explicite autour de la partie N

membrane de telle façon à avoir la position prédite par le serveur OPM, nous avons observé

Chapitre 1 : Préparation des systèmes

F3'H et la membrane, via son hélice transmembranaire uniquement ou également par une interaction de surface. Pour obtenir une première estimation de cette interaction, la structure a été soumise à l'analyse du serveur OPM, qui permet de prédire les interactions entre protéines et membrane par comparaison avec une base de données préexistante.

Les 25 acides aminés structurés en hélice alpha, dans la partie N

prédis comme étant transmembranaires. L'angle de "tilt" de l'hélice par rapport à la surface de la membrane est de 30°. Au delà de cette caractérisation, qui confirme les données expérimentales sur les cytochromes P450, d'autres résidus de l'enzyme ont été identifiés comme interagissant à la surface de la membrane. Ces derniers sont pour la plupart hydrophobes (tryptophane 226, alanine 223, proline 222, isoleucine 37, proline 36, phénylalanine 69). Afin de vérifier si cette prédiction n'est pas un artefact dû à la présence de l'hélice transmembranaire, nous avons décidé de prédire l'interaction avec la membrane de F3'H en enlevant la partie N-terminale. Il est intéressant de noter que les même

aminés sont retrouvés en interaction avec la membrane, laissant supposer un unique mode d'interaction F3'H/membrane. Les différentes portions impliquées dans l'interaction sont donc l'hélice transmembranaire, jouant le rôle d'ancre membranaire, ainsi les résidus 222

nteragissant à la surface. Ces derniers peuvent empêcher des mouvements trop importants de l'enzyme lorsque cette dernière est liée. L'interaction est représentée sur la

: à gauche, représentation de l'interaction F3'H/membrane prédite par le serveur droite, détail de l'interaction de surface et des chaînes secondaires des

impliqués.

En se basant sur ce positionnement, le logiciel Maestro[144], de la suite Schrödinger, a été utilisé pour placer la membrane explicite autour de la partie N-terminale. En plaçant la rane de telle façon à avoir la position prédite par le serveur OPM, nous avons observé F3'H et la membrane, via son hélice transmembranaire uniquement ou également par une eraction, la structure a été soumise à l'analyse du serveur OPM, qui permet de prédire les interactions entre protéines et membrane par comparaison avec une base de données préexistante.

artie N-terminale, ont été prédis comme étant transmembranaires. L'angle de "tilt" de l'hélice par rapport à la surface de la membrane est de 30°. Au delà de cette caractérisation, qui confirme les données résidus de l'enzyme ont été identifiés comme interagissant à la surface de la membrane. Ces derniers sont pour la plupart hydrophobes (tryptophane 226, alanine 223, proline 222, isoleucine 37, proline 36, tion n'est pas un artefact dû à la présence de l'hélice transmembranaire, nous avons décidé de prédire l'interaction avec la membrane de terminale. Il est intéressant de noter que les mêmes acides avec la membrane, laissant supposer un unique mode d'interaction F3'H/membrane. Les différentes portions impliquées dans l'interaction sont donc l'hélice transmembranaire, jouant le rôle d'ancre membranaire, ainsi les résidus 222-227, 35-

nteragissant à la surface. Ces derniers peuvent empêcher des mouvements trop importants de l'enzyme lorsque cette dernière est liée. L'interaction est représentée sur la

ne prédite par le serveur chaînes secondaires des résidus

, de la suite Schrödinger, a terminale. En plaçant la rane de telle façon à avoir la position prédite par le serveur OPM, nous avons observé

Chapitre 1 : Préparation des systèmes

91 effectivement une interaction de surface avec les zones 35-36 et 222-227, sans provoquer de phénomènes d'encombrement stériques, qui entraînerait un déséquilibre trop grand dans le système. La membrane est traitée par le champ de force GAFF lipids, et est représentée par un modèle POPC pour les lipides utilisés. 332 lipides de type POPC ont donc été placés pour former la couche lipidique, puis le solvant est ajouté, pour un total de 118000 atomes.