Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR
II) Protocole des simulations hybrides
II.1)Choix de la partie quantique
Dans notre système, la partie quantique est composée d'un total de 96 atomes et est traitée par une variante plus élaborée de la méthode semi-empirique "tight-binding" DFT, appelée SCC-DFTB (Self-Consistent Charge DFTB)[151, 152]. Dans celle-ci, les charges des atomes de la partie quantique sont optimisées au travers d'un cycle auto-cohérent qui prend en compte les charges de la partie MM lors de la résolution de ces cycles.
La molécule de NADPH étant composée d’un nombre important d’atomes (74 atomes), nous avons choisi de ne pas la prendre en compte en totalité dans la partie quantique. Dans le cas contraire, des interactions susceptibles de perturber l'équilibre du système quantique seraient prises en compte, et alourdiraient le temps de calcul associé à la résolution de l'hamiltonien. Afin de vérifier que la troncature de cette partie n'altère pas les charges sur la partie réactive du cofacteur (cycle dihydropyrimidique et groupement ose, cf Figure 34), les charges entre le cofacteur complet et la molécule tronquée ont été comparées au moyen de calculs de chimie quantique (niveau B3LYP//6-31++G**). Les résultats indiquent que les charges sont identiques entre le modèle tronqué et la molécule complète, ce qui permet de valider la pertinence de la coupure pour le cofacteur, ainsi qu'une bonne représentation du comportement de sa partie réactive.
La partie quantique de notre système sera donc constituée de notre molécule tronquée de NADPH, du substrat considéré en totalité et de parties de chaînes latérales de trois résidus de l'enzyme : tyrosine 163, lysine 167 et sérine 128. Plusieurs tests préliminaires ont montré qu’il était nécessaire de considérer la totalité de la triade catalytique de l'enzyme pour obtenir une description correcte de la réaction. Au final, 4 link atoms sont donc retenus pour séparer
Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR
la molécule de NADPH et les 3 résidus du site actif la seconde moitié du cofacteur et le solvant
du champ de force. Au total, le no atomes plus les 4 "link atoms").
Figure 34 : Représentation de la partie
considérés dans la partie quantique. Les atomes oranges désignent les quatre "link atom" pour les résidus S128,Y163, K167 et le cofacteur NADPH.
II.2)Apport du protocole d'Umbrella Sampling et choix des
contraintes
Un protocole de dynamique moléculaire, couplé à
hybride QM/MM, permet de prendre en compte les phénomènes dynamiques de l'environnement et leurs influences
moléculaire obéit à la statistique de Boltzmann, qui impose que les états échantillonnés sont associés à une énergie potentielle fortement négative, gage de stabilité du système, et
probabilité élevée. L'échantillonnage d'un état de faible état de transition, ne pourra être que
au cours d’une simulation non biaisée
couplage des simulations de DM QM/MM
L'introduction d'un biais va nous permettre de suivre la variation d'énergie libre par rapp cette contrainte. Ainsi, une fois le biais défini de façon adéquate, il sera possible
Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR
la molécule de NADPH et les 3 résidus du site actif du reste de l’'enzyme.
la seconde moitié du cofacteur et le solvant, font partie intégrante de la partie traité
Au total, le nombre d'atomes dans la partie quantique s'élève à 94. (90 atomes plus les 4 "link atoms"). La Figure 34 montre de manière détaillée la partie quantique.
: Représentation de la partie QM. En licorice sont représentés les différents atomes considérés dans la partie quantique. Les atomes oranges désignent les quatre "link atom"
pour les résidus S128,Y163, K167 et le cofacteur NADPH.
Apport du protocole d'Umbrella Sampling et choix des
de dynamique moléculaire, couplé à cette représentation par
hybride QM/MM, permet de prendre en compte les phénomènes dynamiques de leurs influences sur la partie réactive. Cependant, la dynamique ire obéit à la statistique de Boltzmann, qui impose que les états échantillonnés sont associés à une énergie potentielle fortement négative, gage de stabilité du système, et
hantillonnage d'un état de faible probabilité, comme par exemple un état de transition, ne pourra être que très difficilement, voire quasiment impossible à observer au cours d’une simulation non biaisée. Une solution pour étudier la réaction est de réaliser un
des simulations de DM QM/MM avec un protocole d'Umbrella Sampling. L'introduction d'un biais va nous permettre de suivre la variation d'énergie libre par rapp
Ainsi, une fois le biais défini de façon adéquate, il sera possible . Celle-ci, ainsi que font partie intégrante de la partie traitée à l’aide mbre d'atomes dans la partie quantique s'élève à 94. (90 montre de manière détaillée la partie quantique.
sont représentés les différents atomes considérés dans la partie quantique. Les atomes oranges désignent les quatre "link atom"
Apport du protocole d'Umbrella Sampling et choix des
cette représentation par méthode hybride QM/MM, permet de prendre en compte les phénomènes dynamiques de sur la partie réactive. Cependant, la dynamique ire obéit à la statistique de Boltzmann, qui impose que les états échantillonnés sont associés à une énergie potentielle fortement négative, gage de stabilité du système, et donc de me par exemple un très difficilement, voire quasiment impossible à observer udier la réaction est de réaliser un protocole d'Umbrella Sampling. L'introduction d'un biais va nous permettre de suivre la variation d'énergie libre par rapport à Ainsi, une fois le biais défini de façon adéquate, il sera possible
d’échantillonner les états de haute énergi contrainte la représente pertinemment
simulations réalisées, un retraitement des trajectoires par l
d'extraire les variations d'énergie en fonction de la contrainte. Un potentiel de force moyenne, pouvant être assimilé à une variation d'enthalpie libre le long de la coordonnée de réaction, est alors obtenu. D’un point de vue pratique, afin d’
(proton ou hydrure), il est nécessaire de ne pas appliquer l’algo quantique. En effet, cet algorithme permet de «
cette obligation est qu’il est désormais nécessaire de définir un pas d'intégration plus petit permettant de simuler les vibrations
dans ce type de calcul.
Figure 35 : Mécanisme enzymatique
L'hydrure est fourni par le cofacteur NADPH. Les résidus Y163 et cascade de transferts de protons. Pour rappel, DHQ : Dihydroquer
Notre réaction implique d'hydrure provenant du cofacteur
transfert de protons impliquant les résidus Tyr 163 et Lys 167 de l'enzyme
nouvelle fois le NADPH doit avoir lieu. La lysine doit ensuite être reprotonée par le solvant pour permettre à l'enzyme d'
mécanisme proposé est rappelé sur la
Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR
échantillonner les états de haute énergie associés à la coordonnée de réaction pertinemment), et donc d'étudier une réaction chimique. simulations réalisées, un retraitement des trajectoires par le logiciel WHAM
ergie en fonction de la contrainte. Un potentiel de force moyenne, pouvant être assimilé à une variation d'enthalpie libre le long de la coordonnée de réaction, est D’un point de vue pratique, afin d’observer ces transferts d'atomes hydrogènes
il est nécessaire de ne pas appliquer l’algorithme SHAKE pour la partie quantique. En effet, cet algorithme permet de « geler » les liaisons de type X
cette obligation est qu’il est désormais nécessaire de définir un pas d'intégration plus petit permettant de simuler les vibrations le long des liaisons X-H. Le pas est ainsi fixé à
: Mécanisme enzymatique de la réduction du substrat par l'enzyme
L'hydrure est fourni par le cofacteur NADPH. Les résidus Y163 et K167 participent à la cascade de transferts de protons. Pour rappel, DHQ : Dihydroquercétine, DHK :
Dihydrokaempferol.
implique la réduction du groupement cétone du substrat par un transfert venant du cofacteur. Afin d’accéder aux produits de la réaction, u
transfert de protons impliquant les résidus Tyr 163 et Lys 167 de l'enzyme
nouvelle fois le NADPH doit avoir lieu. La lysine doit ensuite être reprotonée par le solvant pour permettre à l'enzyme d'être régénérée et ainsi terminer le cycle catalytique. Le mécanisme proposé est rappelé sur la Figure 35.
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99 à la coordonnée de réaction (si notre d'étudier une réaction chimique. Une fois les e logiciel WHAM[148] permettra ergie en fonction de la contrainte. Un potentiel de force moyenne, pouvant être assimilé à une variation d'enthalpie libre le long de la coordonnée de réaction, est observer ces transferts d'atomes hydrogènes rithme SHAKE pour la partie » les liaisons de type X-H. Le corolaire à cette obligation est qu’il est désormais nécessaire de définir un pas d'intégration plus petit Le pas est ainsi fixé à 0,5 ps
de la réduction du substrat par l'enzyme DFR. K167 participent à la
cétine, DHK :
réduction du groupement cétone du substrat par un transfert aux produits de la réaction, une cascade de transfert de protons impliquant les résidus Tyr 163 et Lys 167 de l'enzyme, ainsi qu'une nouvelle fois le NADPH doit avoir lieu. La lysine doit ensuite être reprotonée par le solvant être régénérée et ainsi terminer le cycle catalytique. Le
Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR
Nous avons donc au total quatre différents partenaires biologiques qui sont impliqués dans la totalité de la réaction. Il est donc plus difficile d'identifier de manière précise la coordonnée de réaction. Notre choix s'est porté sur la représentation de ces différents transferts par une seule contrainte, correspondant au transfert d'hydrure provenant du cofacteur dans un premier temps, arguant du fait que ce transfert entrainerait les transfert protons. Nous avons également testé une contrainte représentant le transfert de proton provenant de la tyrosine afin de vérifier si le transfert d’hydrure pouvait in
second temps lors de la réaction. Ces tests nous ont montré qu'une seule contrainte «
ne peut représenter pertinemment la coordonnée de réaction du mécanisme. Des simulations impliquant deux coordonnées de réactions ont été effect
associées indépendamment au
Figure 36 : Schéma des distances impliquées dans la définition des coordonnées de réaction. Le transfert d'hydrure est mo
transfert de proton venant de la tyrosine 163 est représentée par
Chaque contrainte a été choisie linéaire de deux distances. Cela permet
Par exemple, pour simuler le transfert d'hydrure, la coordonnée de réaction est la combinaison linéaire de la distance entre l'hydrure et l'atome de car
d1) et celle entre l'hydrure et l'atome de carbone du substrat qui va être réduit
Pour la contrainte sur le transfert de proton, la coordonnée est constituée de la combinaison linéaire entre la distance tyrosine
Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR
Nous avons donc au total quatre différents partenaires biologiques qui sont impliqués la réaction. Il est donc plus difficile d'identifier de manière précise la coordonnée de réaction. Notre choix s'est porté sur la représentation de ces différents transferts par une seule contrainte, correspondant au transfert d'hydrure provenant du
eur dans un premier temps, arguant du fait que ce transfert entrainerait les transfert protons. Nous avons également testé une contrainte représentant le transfert de proton provenant de la tyrosine afin de vérifier si le transfert d’hydrure pouvait in
second temps lors de la réaction. Ces tests nous ont montré qu'une seule contrainte «
ne peut représenter pertinemment la coordonnée de réaction du mécanisme. Des simulations impliquant deux coordonnées de réactions ont été effectuées, basées sur deux contraintes associées indépendamment aux transferts d'hydrure et du premier proton.
: Schéma des distances impliquées dans la définition des coordonnées de réaction. Le transfert d'hydrure est modélisé par la contrainte CR1 (égale à d1-d2), tandis que le transfert de proton venant de la tyrosine 163 est représentée par le biais CR 2
d4).
a été choisie, après plusieurs tests, comme étant une combinaison . Cela permet une meilleure représentation des transferts
Par exemple, pour simuler le transfert d'hydrure, la coordonnée de réaction est la combinaison linéaire de la distance entre l'hydrure et l'atome de carbone du NADPH qui le p
l'hydrure et l'atome de carbone du substrat qui va être réduit
Pour la contrainte sur le transfert de proton, la coordonnée est constituée de la combinaison linéaire entre la distance tyrosine-proton transférable et la distance proton
CR 1 = d1 CR 2 = d3
Nous avons donc au total quatre différents partenaires biologiques qui sont impliqués la réaction. Il est donc plus difficile d'identifier de manière précise la coordonnée de réaction. Notre choix s'est porté sur la représentation de ces différents transferts par une seule contrainte, correspondant au transfert d'hydrure provenant du eur dans un premier temps, arguant du fait que ce transfert entrainerait les transferts de protons. Nous avons également testé une contrainte représentant le transfert de proton provenant de la tyrosine afin de vérifier si le transfert d’hydrure pouvait intervenir dans un second temps lors de la réaction. Ces tests nous ont montré qu'une seule contrainte « simple » ne peut représenter pertinemment la coordonnée de réaction du mécanisme. Des simulations uées, basées sur deux contraintes
: Schéma des distances impliquées dans la définition des coordonnées de réaction. , tandis que le CR 2 (égale à d3 -
, après plusieurs tests, comme étant une combinaison une meilleure représentation des transferts d'atomes. Par exemple, pour simuler le transfert d'hydrure, la coordonnée de réaction est la combinaison bone du NADPH qui le porte (nommée l'hydrure et l'atome de carbone du substrat qui va être réduit (nommée d2). Pour la contrainte sur le transfert de proton, la coordonnée est constituée de la combinaison e et la distance proton-atome d'oxygène
= d1 - d2 = d3 - d4
Chapitre 2 : Etude de la réactivité de DFR
101 du groupement cétone réduit par la réaction (respectivement appelée d3 et d4). La Figure 36 représente les contraintes choisies.
Les paramètres des potentiels harmoniques associés aux biais sont choisis selon des études déjà publiées[153]. Pour chaque contrainte, les paramètres utilisés sont listés ci-après :
- Transfert d'hydrure : constante de force choisie à 20 kcal/mol; espacement entre fenêtre de 0,15 Å; 35 ps d'échantillonnage dans chaque fenêtre et la contrainte varie de -1,80 à 1,35 Å.
- Transfert de proton : constante de force choisie à 20 kcal/mol; espacement entre fenêtre de 0,15 Å; 35 ps d'échantillonnage pour chaque fenêtre et la contrainte varie de -0,90 à 1,20 Å.