III.1)
La dihydroflavonol-4-réductase (DFR)
La dihydroflavonol-4-réductase est une enzyme composée de 329 acides aminés et appartenant à la classe des SDR (Short-chain dehydrogenases/reductase). Ce sont des enzymes qui catalysent plusieurs types de réactions (réduction, oxydation, isomérisation...), mais qui nécessitent la participation d'un cofacteur NADPH ou NADH [62, 63]. Même si le pourcentage d'identité sur toutes les SDR ne dépasse pas les 30%, les structures tridimensionnelles connues de ces enzymes montrent une haute conservation [64]. Par exemple, nous pouvons citer le site d'interaction du cofacteur, composé d'un motif riche en glycine (Gly-X3-Gly-X-Gly) et d'un motif structural de type "Rossmann Fold" (succession de 6 feuillets béta parallèles couplés à deux paires d'hélices alpha [65]) conservé dans plus de 80% des SDR cristallisés. Le site actif est grandement conservé, notamment trois acides aminés : une sérine, une tyrosine et une lysine, qui constituent la triade catalytique essentielle à la réactivité des SDR. Le motif est de type Ser...Tyr-X3-Lys et est conservé dans plus de 80% des SDR, mais l'absence de l'acide aminé tyrosine n'est pas forcément synonyme de non- fonctionnement de l'enzyme. En effet, elle peut être remplacée par une histidine dans certains organismes [66]. Cette triade intervient dans le mécanisme par une cascade de transfert de protons, impliquant la tyrosine, le cofacteur et la lysine [67]. La sérine permet quand à elle la création d'une liaison hydrogène qui stabilise la fonction réactive du substrat. Dans certaines SDR, on peut même parler de tétrade catalytique avec la présence d'une asparagine aidant à la reprotonation de la lysine après réaction, mais ce cas reste rare [63]. Les connaissances sur les différents protagonistes de la réaction sont ainsi bien renseignées, mais pour le moment nous ne savons pas si le mécanisme est par étape ou concerté.
En 2007, Petit et al. ont cristallisé l'enzyme DFR présente dans l'organisme Vitis
vinifera [68] sous la forme d'un complexe ternaire (c'est à dire co-cristallisé avec le cofacteur,
NADP+ et un substrat connu, la dihydroquercétine, voir Figure 15). Le site actif a pu être ainsi caractérisé, mais également les domaines de liaison du cofacteur et du substrat. La triade catalytique est composée de la sérine 128, la tyrosine 163 et la lysine 167. Les résidus de reconnaissance de la dihydroquercétine sont la glutamine 227 et l'asparagine 133. Des études de mutagénèse dirigée montrent que la mutation du résidu 133 hautement conservé ( en aspartate ou leucine) modifie grandement la sélectivité de DFR vis-à-vis de ses substrats. L'asparagine permettrait une sélectivité de la dihydroquercétine par rapport au
dihydrokaempferol (voir Figure
supplémentaire sur la dihydroquercétine. Si conversion des deux substrats (d
réductase de Vitis vinifera, soit une inversion de la sélectivité en faveur du dihydrokaempferol dans l'enzyme présente dans l'organisme
que revêt ce résidu dans le reconnaissance du substrat
Figure 15 : à gauche, structure tridimensionnelle de l'enzyme DFR obtenu par Petit
al.(PDB ID:2C29). A droite
L'identification des résidus permet de faire une proposition du mécanisme de réduction de la dihydroquercétine en leucocyanidine, comme mont
.
Figure 16 : Proposition
Figure 6) par l'interaction avec l'hydroxyle du cycle B supplémentaire sur la dihydroquercétine. Si le résidu est muté, on observe soit une chute de la conversion des deux substrats (d'après le travail de Petit et al.[68]) dans la dihydroflavonol
, soit une inversion de la sélectivité en faveur du dihydrokaempferol dans l'enzyme présente dans l'organisme Gerbera [69]. Ces deux points montrent l'importance que revêt ce résidu dans le reconnaissance du substrat par l'enzyme.
tructure tridimensionnelle de l'enzyme DFR obtenu par Petit . A droite, détail des résidus du site actif interagissant avec le substrat
représentation de la cavité de liaison.
ésidus permet de faire une proposition du mécanisme de réduction tine en leucocyanidine, comme montrée sur la Figure 16
: Proposition de mécanisme enzymatique réalisée par la DFR.
Introduction
41 l'hydroxyle du cycle B le résidu est muté, on observe soit une chute de la ) dans la dihydroflavonol-4- , soit une inversion de la sélectivité en faveur du dihydrokaempferol
deux points montrent l'importance
tructure tridimensionnelle de l'enzyme DFR obtenu par Petit et interagissant avec le substrat et
ésidus permet de faire une proposition du mécanisme de réduction 16.
Introduction
Le cofacteur NADPH transfert un hydrogène sous forme d'hydrure de manière stéréospécifique (configuration de type pro-S) sur le groupement cétone, ce qui implique sa réduction en alcoolate. Ce groupement sera ensuite protonné en hydroxyle selon un mécanisme basé sur une cascade de transfert de protons impliquant la tyrosine 163, le NADPH une seconde fois et enfin la lysine 167. La sérine 123 de la triade interagit avec le groupement cétone afin de le préparer à la réaction.
D'autres cristaux de DFR ont également été obtenus (PDB id : 3C1T et 3BXX). Basée sur leur structure, une inhibition de l'activité de l'enzyme peut être envisagée par interaction avec des flavonols [70]. Enfin, une étude cinétique récente montre que l'excès de dihydroquercétine peut être également un facteur d'inhibition de l'enzyme, par formation d'un complexe enzyme-dihydroquercétine abortif ou d'un complexe ternaire non productif [71]. Ce dernier point sera abordé dans ce document au sein d'une partie annexe.
III.2)
La leucocanthocyanidine réductase (LAR)
La leucoanthocyanidine réductase est une enzyme composée de 346 résidus, et qui appartient à une sous famille de réductase dérivée des SDR, les PIP (Pinoresinol–lariciresinol reductase, Isoflavone reductase, et Phenylcoumaran benzylic ether reductase like) [72]. Le point commun principal des trois enzymes qui composent cette famille est leur capacité de clivage d'une liaison carbone-oxygène liée à un para-phénol. Cette réaction est assez éloignée des réactions classiques des SDR, qui consistent en une réduction d'une double liaison C-C ou C-O en simple liaison. Une autre caractéristique de cette sous famille d'enzymes est l'absence de la triade catalytique, contrairement aux autres SDR. La tyrosine et la lysine sont les seuls résidus présents de la triade, la lysine possédant un rôle catalytique important [73].
Dans leur étude, Maugé et al. [74] ont cristallisé LAR sous trois états :
• une forme apo de l'enzyme, c'est à dire vide de tout partenaire biologique (PDB ID : 3I5M)
• une structure avec seulement le cofacteur (PDB ID : 3I6I).
• un complexe ternaire enzyme/NADPH/catéchine (le produit de la réaction) (PDB ID : 3I52). Elle est représentée sur la Figure 17.
Figure 17 : Structure de LAR correspondante au site actif et les différentes
Le site de fixation du cofacteur est très similaire au Fold". L'histidine 122, la lysine 140 et la tyrosine 137 jouent probablement un rôle dan
du complexe tertiaire permet de comprendre comment le site actif est organisé aut cofacteur et du substrat. Maugé
différente de ce que l'on peut observer dans une SDR 18, implique que la lysine 140,
déprotonée pour jouer le rôle de base et Ces deux conditions seraient nécessaire
Figure 18: Mécanisme proposé par Maugé
: Structure de LAR correspondante au fichier PDB 3I52. A droite, un zoom sur le site actif et les différentes résidus impliqués dans l'interaction avec le substrat
représentation de la cavité de liaison.
Le site de fixation du cofacteur est très similaire aux SDR, avec un motif 'histidine 122, la lysine 140 et la tyrosine 137 interagissent avec le nt probablement un rôle dans la reconnaissance du substrat (leucocyanidine)
permet de comprendre comment le site actif est organisé aut Maugé et al. ont proposé une hypothèse de mécanisme qui e que l'on peut observer dans une SDR. Ce mécanisme, représenté
140, considérée comme étant la lysine catalytique des PIP pour jouer le rôle de base et qu'une histidine protonée qui jouerait le rôle d'acide. Ces deux conditions seraient nécessaires à l'initiation de la réaction.
: Mécanisme proposé par Maugé et al. pour la transformation de leucocyanidine en catéchine. Tiré de la ref [74].
Introduction
43
A droite, un zoom sur le résidus impliqués dans l'interaction avec le substrat, ainsi que la
un motif "Rossman interagissent avec le produit, et donc s la reconnaissance du substrat (leucocyanidine). L'obtention permet de comprendre comment le site actif est organisé autour du proposé une hypothèse de mécanisme qui est très Ce mécanisme, représenté sur la Figure étant la lysine catalytique des PIP, soit ne histidine protonée qui jouerait le rôle d'acide.
Introduction
III.3)
La flavonoide-3'-hydroxylase (F3'H)
L'enzyme flavonoide-3'-hydroxylase est composée de 509 acides aminés et appartient à la famille des cytochromes P450 (CYP). C'est une famille de protéines très répandue dans le vivant et qui catalyse généralement des réactions d'oxydation. Elle permet la synthèse de molécules vitales pour l'Homme (Vitamine D, œstrogène, testostérone... ). Dans le métabolisme de drogues, 75% des réactions mises en jeu impliquent une enzyme de type cytochrome P450 [75]. A ce jour, plus de 18 classes de cytochromes P450, basées sur la nature de leurs substrats, ont été identifiées dans le corps humain, et pas moins de 18000 protéines différentes réparties dans tout le monde du vivant, y compris les virus, ont pu être découvertes [76]. Tous les membres de cette famille ont une identité de 40% sur leur séquence primaire, ainsi que des caractéristiques structurales très proches. Dans les organismes eucaryotes, les enzymes de type CYP sont toutes liées à la membrane par leur partie N-terminale [59, 77]. Seules les cytochromes bactériennes n'interagissent pas avec la membrane. La Figure 19 représente la structure obtenue par diffraction de rayons X d'une enzyme de type cytochrome P450 (la cytochrome humaine P450 1A2 [78]). Nous pouvons noter que la partie N-terminale est tronquée (voir Figure 19 en rouge) car elle empêche de manière systématique la cristallisation des enzymes de cette catégorie.
Figure 19 : Structure cristallographique de l'enzyme humaine Cytochrome P450 1A2. La partie N-terminale, transmembranaire, n'est pas représentée car non présente dans la
Introduction
45 Ces enzymes possèdent toutes un groupement hème dans leur site actif qui va être le principal donneur d'électrons (grâce à son atome de fer) dans les réactions d'oxydations. Ce cofacteur est lié à l'enzyme par une liaison de coordination avec un atome de soufre d'une cystéine, ainsi que par des interactions ioniques. Toutes les enzymes de type cytochrome P450 utilisent de manière générale un donneur d'électrons externe pour finaliser la réaction (cytochrome P450 réductase possédant en son sein une molécule de NADPH réalisant le transfert d'électrons [58]). La réaction fait intervenir l'atome de fer au centre du groupement hème.
A ce jour, plus de 60 structures de cytochromes P450 ont été cristallisées et résolues, la plupart issues du corps humain et des bactéries [79]. Malheureusement, la structure cristallographique associée à la flavonoide-3'-hydroxylase est manquante. Son rôle n'est pourtant pas à négliger : au delà de la catalyse de la réaction d'hydroxylation du cycle B des flavonoïdes, elle participerait à la stabilisation d'un possible métabolon en jouant le rôle d'ancre à la membrane.