Calculs de docking sur l'enzyme seule

III.1)

Protocole de simulation

Les simulations de dynamique moléculaire suggèrent que la formation d'un complexe DFR-DHQ est possible. Les calculs de DM brute force nécessitent des moyens de calculs conséquents. Nous avons choisi d'échantillonner différentes conformations du complexe DFR-DHQ à l'aide de calculs de docking. Ceux-ci seront raffinés par la suite par de courtes simulations de DM. Ainsi, une campagne de docking a été réalisée afin de déterminer les différentes positions que peut prendre le DHQ dans l'enzyme vide. Ils ont été réalisés à l’aide du logiciel Autodock Vina. La grille définie pour les calculs est de dimension 26x26x28, permettant ainsi d'englober tout le site actif de DFR. Après quelques tests, le paramètre "Exhaustiveness" a été réglé sur une valeur de 12.

III.2)

Résultats

De ces calculs se dégagent trois structures de complexes enzymes-substrats. Les trois clusters regroupent au total 20 positions différentes :

Un ensemble de positions regroupées autour de la pose cristallographique du complexe ternaire. En absence de cofacteur, différentes orientations du substrat sont mises en avant. Il correspond au site B sur la Figure 85.

Un ensemble localisé sur le site de liaison du cofacteur, correspondant à la position A. Un troisième groupe de position au niveau de la voie d'accès 2 du site actif (Voir chapitre 3), associé au site C.

Ces trois clusters sont représentés sur la Figure 85. Deux positions pour le groupe associé à la position cristallographique sont représentées.

Chapitre Annexe : Modèle d'inhibition de DFR par excès de substrat

Figure 85 : Coupe transversale de l'enzyme montrant

de docking. Les sites A, B et C représentent respectivement le site du cof

cristallographique du DHQ dans le complexe ternaire et la pose associée à l'entrée de la cavité par la voie d'accès 2

La formation d'un complexe abortif DFR

fixation du NADPH, est un élément de réponse au phénomène d'inhibition de l'enzyme. Par ailleurs, nous échantillonnons plusieurs positions autour de la position cristallographique comme le montre la Figure

permet la réactivité.

Pour le premier cluster, représenté par les images a) et b) de la impliqués dans l'interaction a

complexe ternaire. On retrouve des liaisons hydrogènes fortes avec les résidus de reconnaissance (N133 et Q227) ainsi qu'un des résidus de la triade catalytique, S128. Les résidus A129, M88, L192, V193 et V194 sont impliqués dans des interaction

hydrophobe avec les cycles C et B de la dihydroquercétine.

Dans le cas du second cluster, représenté par l'image c), le DHQ est situé dans le site de liaison du NADPH. Les résidus

Chapitre Annexe : Modèle d'inhibition de DFR par excès de substrat

: Coupe transversale de l'enzyme montrant ainsi les 3 clusters obtenus par Les sites A, B et C représentent respectivement le site du cofacteur, la position cristallographique du DHQ dans le complexe ternaire et la pose associée à l'entrée de la

cavité par la voie d'accès 2. Pour le site B, deux positions sont représentées.

La formation d'un complexe abortif DFR-DHQ, ce dernier tant situé

fixation du NADPH, est un élément de réponse au phénomène d'inhibition de l'enzyme. Par ailleurs, nous échantillonnons plusieurs positions autour de la position cristallographique Figure 85. Certaines révèlent une orientation différente de celle qui

Pour le premier cluster, représenté par les images a) et b) de la Figure

impliqués dans l'interaction avec le substrat sont pratiquement tous les mêmes que dans le complexe ternaire. On retrouve des liaisons hydrogènes fortes avec les résidus de reconnaissance (N133 et Q227) ainsi qu'un des résidus de la triade catalytique, S128. Les

, V193 et V194 sont impliqués dans des interaction hydrophobe avec les cycles C et B de la dihydroquercétine.

Dans le cas du second cluster, représenté par l'image c), le DHQ est situé dans le site de liaison du NADPH. Les résidus G15, A85, M88, T86, P190, et K167 intera

Chapitre Annexe : Modèle d'inhibition de DFR par excès de substrat

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ainsi les 3 clusters obtenus par calcul acteur, la position cristallographique du DHQ dans le complexe ternaire et la pose associée à l'entrée de la

Pour le site B, deux positions sont représentées.

DHQ, ce dernier tant situé dans le site du fixation du NADPH, est un élément de réponse au phénomène d'inhibition de l'enzyme. Par ailleurs, nous échantillonnons plusieurs positions autour de la position cristallographique . Certaines révèlent une orientation différente de celle qui

Figure 85, les résidus vec le substrat sont pratiquement tous les mêmes que dans le complexe ternaire. On retrouve des liaisons hydrogènes fortes avec les résidus de reconnaissance (N133 et Q227) ainsi qu'un des résidus de la triade catalytique, S128. Les , V193 et V194 sont impliqués dans des interactions de type

Dans le cas du second cluster, représenté par l'image c), le DHQ est situé dans le site T86, P190, et K167 interagissent de

Chapitre Annexe : Modèle d'inhibition de DFR par excès de substrat

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manière hydrophobe avec le su

hydrogène sont créées avec les résidus S127, I17 et S14.

Enfin, un troisième cluster a été identifié à l'interface entre la phase solva l'enzyme, au niveau de la voie d'accès 2. Ce site peut être assimilé à une position transitoire lors de l'entrée de la molécule dans la cavité vide. Le substrat interagit avec

L192, I222, R224 et Q225 avec des interactions de type Van der

, N133, I222, R224 et Q225 forment de faibles interactions hydrophiles. Le détail des résidus impliqués dans les trois clusters sont représentés sur la

Figure 86 : Détails des interactions dans le cas des trois clusters identifiés durant les calculs de docking. a) et b) montrent les deux meilleures poses du cluster de la pose cristallographique, de la même manière que la

cluster associé au site de liaison du cofacteur et d) présente la pose associée à la sortie 2

Une analyse des propriétés physico

que le site A présente un caractère amphiphile (autant hydrophile qu'hydrophobe), tandis que les deux autre sites ont un caractère plutôt hydrophobe (ratio hydrophobe/hydrophile respectif des sites B et C : 60/40 et 61,5/38,5). Ces observations apportent des éléments de

quant au site préférentiel d'interaction avec le DHQ. En effet, les flavonoïdes présentent des aspects autant hydrophobes (caractère aromatique) qu'hydrophiles (liaisons hydrogène avec

'inhibition de DFR par excès de substrat

avec le substrat (notamment le cycle C), tandis que des liaisons hydrogène sont créées avec les résidus S127, I17 et S14.

Enfin, un troisième cluster a été identifié à l'interface entre la phase solva l'enzyme, au niveau de la voie d'accès 2. Ce site peut être assimilé à une position transitoire lors de l'entrée de la molécule dans la cavité vide. Le substrat interagit avec

avec des interactions de type Van der Waals, tandis que les résidus forment de faibles interactions hydrophiles. Le détail des résidus impliqués dans les trois clusters sont représentés sur la Figure 86.

: Détails des interactions dans le cas des trois clusters identifiés durant les calculs a) et b) montrent les deux meilleures poses du cluster de la pose

cristallographique, de la même manière que la Figure 85, c) représente la meilleure pose du cluster associé au site de liaison du cofacteur et d) présente la pose associée à la sortie 2

Une analyse des propriétés physico-chimique des différents sites de la cavité montre présente un caractère amphiphile (autant hydrophile qu'hydrophobe), tandis que les deux autre sites ont un caractère plutôt hydrophobe (ratio hydrophobe/hydrophile respectif

B et C : 60/40 et 61,5/38,5). Ces observations apportent des éléments de

quant au site préférentiel d'interaction avec le DHQ. En effet, les flavonoïdes présentent des aspects autant hydrophobes (caractère aromatique) qu'hydrophiles (liaisons hydrogène avec (notamment le cycle C), tandis que des liaisons

Enfin, un troisième cluster a été identifié à l'interface entre la phase solvant et l'enzyme, au niveau de la voie d'accès 2. Ce site peut être assimilé à une position transitoire lors de l'entrée de la molécule dans la cavité vide. Le substrat interagit avec A129, I134, Waals, tandis que les résidus forment de faibles interactions hydrophiles. Le détail des résidus

: Détails des interactions dans le cas des trois clusters identifiés durant les calculs a) et b) montrent les deux meilleures poses du cluster de la pose

c) représente la meilleure pose du cluster associé au site de liaison du cofacteur et d) présente la pose associée à la sortie 2.

chimique des différents sites de la cavité montre présente un caractère amphiphile (autant hydrophile qu'hydrophobe), tandis que les deux autre sites ont un caractère plutôt hydrophobe (ratio hydrophobe/hydrophile respectif B et C : 60/40 et 61,5/38,5). Ces observations apportent des éléments de réponses quant au site préférentiel d'interaction avec le DHQ. En effet, les flavonoïdes présentent des aspects autant hydrophobes (caractère aromatique) qu'hydrophiles (liaisons hydrogène avec

Chapitre Annexe : Modèle d'inhibition de DFR par excès de substrat

groupements hydroxyles), mais sont solubles dans de nombreux (qui permettent par ailleurs leur extraction)

préférentielle avec le site présentant le plus de caractère hydrophile. Un calcul local du potentiel électrostatique montre que le site du NADPH présente également des propriétés électrostatiques plus prononcées que les autres sites, ce qui appuie n

observation sur la préférence du DHQ pour la liaison avec le site A. L'évolution de ce potentiel est représentée sur la

Figure 87 : Evolution du potentiel élect

représenté le sens de la coordonnée de réaction. A droite est montrée l'évolution du potentiel électrostatique en fonction de la position du substrat dans la cavité. L'origine a été choisie à la position cristallographique de DHQ dans le complexe ternaire enzyme

Pour raffiner l'interaction ligand

calculs de docking, chaque cluster a été soumis à des simulations de

Dans le cas du cluster représentant la position cristallographique, nous avons décidé d'améliorer l'échantillonnage en prenant un grand nombre d'orientation du substrat dans cette position. Ainsi, 8 conformations (3 obtenues par les

manuellement avec le logiciel obtenues selon une approche "head (représentés en c et d dans les Figures 1

énergies d'interaction obtenues par protocoles de docking ont été conservées. Au total 14 systèmes différents ont été soumis à des simulations de DM.

Chapitre Annexe : Modèle d'inhibition de DFR par excès de substrat

groupements hydroxyles), mais sont solubles dans de nombreux solvants protiques polaires (qui permettent par ailleurs leur extraction)[187]. Ainsi, le DHQ interagirait de m préférentielle avec le site présentant le plus de caractère hydrophile. Un calcul local du potentiel électrostatique montre que le site du NADPH présente également des propriétés électrostatiques plus prononcées que les autres sites, ce qui appuie n

observation sur la préférence du DHQ pour la liaison avec le site A. L'évolution de ce potentiel est représentée sur la Figure 87.

: Evolution du potentiel électrostatique le long de la cavité de DFR. A gauche est représenté le sens de la coordonnée de réaction. A droite est montrée l'évolution du potentiel

électrostatique en fonction de la position du substrat dans la cavité. L'origine a été choisie à cristallographique de DHQ dans le complexe ternaire enzyme-cofacteur

dans le site B.

Pour raffiner l'interaction ligand-récepteur et les observations obtenues sur la base des calculs de docking, chaque cluster a été soumis à des simulations de dynamique moléculaire. Dans le cas du cluster représentant la position cristallographique, nous avons décidé d'améliorer l'échantillonnage en prenant un grand nombre d'orientation du substrat dans cette position. Ainsi, 8 conformations (3 obtenues par les calculs de docking et 5 orientées manuellement avec le logiciel Xleap) ont été retenues. Les différentes orientations ont été obtenues selon une approche "head-tail" and "upside-down". Pour les deux autres clusters (représentés en c et d dans les Figures 1 et 2), les trois positions associées aux meilleures énergies d'interaction obtenues par protocoles de docking ont été conservées. Au total 14 systèmes différents ont été soumis à des simulations de DM.

Chapitre Annexe : Modèle d'inhibition de DFR par excès de substrat

193 solvants protiques polaires . Ainsi, le DHQ interagirait de manière préférentielle avec le site présentant le plus de caractère hydrophile. Un calcul local du potentiel électrostatique montre que le site du NADPH présente également des propriétés électrostatiques plus prononcées que les autres sites, ce qui appuie notre précédente observation sur la préférence du DHQ pour la liaison avec le site A. L'évolution de ce

rostatique le long de la cavité de DFR. A gauche est représenté le sens de la coordonnée de réaction. A droite est montrée l'évolution du potentiel

électrostatique en fonction de la position du substrat dans la cavité. L'origine a été choisie à cofacteur-substrat,

récepteur et les observations obtenues sur la base des dynamique moléculaire. Dans le cas du cluster représentant la position cristallographique, nous avons décidé d'améliorer l'échantillonnage en prenant un grand nombre d'orientation du substrat dans cette calculs de docking et 5 orientées leap) ont été retenues. Les différentes orientations ont été down". Pour les deux autres clusters et 2), les trois positions associées aux meilleures énergies d'interaction obtenues par protocoles de docking ont été conservées. Au total 14

Chapitre Annexe : Modèle d'inhibition de DFR par excès de substrat

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