Au cours de cette étude, j’ai pu montrer qu’en absence de PLD1 les neurones corticaux en culture ont un retard du développement par rapport aux neurones
Pld1+/+. D’autre part, j’ai trouvé qu’en absence de RSK2 les neurones corticaux en
culture ont aussi un retard de développement très semblable à celui observé chez les neurones Pld1-/-. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques contre ces deux classes de protéine ou l’extinction de l’expression de PLD1 ou de RSK2 ont confirmé l’implication de ces deux protéines dans la croissance neuritique induite par le NGF sur des cellules PC12 en culture. Le NGF induit une stimulation rapide de la voie MAPK-ERK1/2, ainsi que la phosphorylation et l’activation de RSK2, suivie par une phosphorylation, dépendante de RSK2, de PLD1 sur sa thréonine 147 qui abouti à une augmentation de l’activité PLD. D’autre part, la stimulation des cellules PC12 par le NGF induit une redistribution périphérique significative de PLD1 et RSK2 et une colocalisation significative des deux protéines à cet endroit. Ceci conduit à une stimulation de l’activité PLD1 et in fine à une augmentation du niveau de PA à la membrane plasmique. Dans les neurones ou les cellules PC12, la PLD1 est
j’ai trouvé que la PLD1-GFP associée à ces structures vésiculaires est transportée vers le cône de croissance des cellules PC12 traitées au NGF, mais subit également un transport rétrograde, du cône vers le corps cellulaire. Ceci suggère une implication potentielle de la PLD1 dans le trafic vésiculaire au cours de la croissance neuritique. Or à ce jour, deux types des vésicules impliquées dans l’apport membranaire au niveau du cône de croissance ont été décrite. Il s’agit des vésicules positives pour Ti-VAMP/VAMP7 et des vésicules positives pour VAMP4 ou enlargeosomes. J’ai trouvé que PLD1-GFP colocalise fortement avec Ti-VAMP au niveau périnucléaire, dans les prolongements et aussi à l’extrémité distale des neurites en croissance. Pour finir, en utilisant une construction VAMP-7 couplé à la pHfluorin et un microscope à onde évanescente, j’ai montré que des inhibiteurs pharmacologiques de RSK2 et PLD1 contrôlent la fusion des vésicules Ti-VAMP avec la membrane plasmique au cours de la croissance neuritique induite par le NGF.
1. Implication de PLD1 dans la croissance neuritique
Le groupe du Dr Kanaho a montré que le NGF induit une augmentation de l’expression de la PLD1 au cours de la différenciation/croissance neuritique des cellules PC12, ainsi que l’augmentation de son activité (Kanaho et al., 2009). De même, Zhu et al., (2012) ont montré que l’expression et l’activité de PLD1 sont fortes au cours de la première semaine du développement des neurones d’hippocampe en culture.
Des études antérieures ont suggéré deux rôles potentiels de la PLD1 dans la croissance neuritique. En effet, il a été démontré que la surexpression de PLD1-GFP dans des neurones d’hippocampe augmente la sécrétion de la serine protéase tPA (Tissue plasminogen activator), induite par la forskoline ou l’ionophore calcique A23187. Ceci conduit également à augmenter la longueur des neurites (Zhang et al., 2005). Ces auteurs ont proposé que la PLD1 stimule la croissance neuritique en favorisant la libération de tPA. D’autre part, Cai et al (2006) ont montré que la surexpression de PLD1 restore la croissance et le branchement neuritique en absence de la préseniline-1, via un mécanisme dépendant du trafic des vésicules contenant la préseniline-1. Il a également été suggéré que la PLD1 régule la
croissance neuritque via la régulation de l’expression de certains gènes tels que Bcl-2 et le NT3 (Choi et al., Bcl-201Bcl-2, Yoon et al., Bcl-201Bcl-2). Ceci suggère un autre rôle de la PLD1 dans la régulation de la croissance neuritique. Ainsi il est possible qu’en plus de son implication dans le contrôle du trafic membranaire, la PLD1 puisse également être impliquée dans la régulation de la signalisation cellulaire et la transcription. En effet, il a été démontré dans d’autres fonctions cellulaires que la PLD1 régule les voies MAPK (Raf-ERK1/2) et la voie mTOR, dont leur rôle crucial dans le développement neuronal la croissance neuritique sont connus.
2. Implication de RSK2 dans la croissance neuritique
A ce jour une seule étude a examinée l’implication de RSK2 dans la croissance neuritique des cellules PC12 stimulées par le NGF. En effet, Silverman et al., (2004) ont montré que la surexpression d’un mutant constitutivement actif de RSK2 n’affecte pas la croissance neuritique et ils suggèrent en revanche un rôle important de RSK1 dans la croissance neuritique. Or dans cette étude, les résultats montrent que l’implication de RSK1 dans la croissance neuritique semble être indépendante du NGF. D’autre part, la surexpression d’un mutant dominant négatif de RSK1 n’affecte pas la croissance neuritique en présence ou en absence de NGF. Un autre point important est que l’utilisation des mutants constitutivement actifs de RSK1 ou RSK2, qui ne peuvent pas lier ERK1/2 ne peuvent pas reproduire fidèlement cette voie d’activation de la croissance neuritique, puisque le NGF induit la croissance neuritique principalement via ERK1/2. On peut donc imaginer que RSK1 puisse être impliqué dans une voie indépendante du NGF, tandis que RSK2 soit lié à cette voie impliquant le NGF (Silverman et al., 2004).
Une autre étude portant sur l’implication de RSK2 dans la croissance axonale de neurones a suggérée que RSK2 régule négativement la croissance axonale des neurones moteurs en culture traités au BDNF et au CNTF (Fischer et al., 2009). En effet, ces auteurs ont montré que les motoneurones Rsk2-/- en culture présentent des axones plus longs et plus branchés par rapport aux neurones Rsk2+/+. D’autre part, ils ont montré que la surexpression de RSK2-GFP n’affecte pas l’allongement
clairement en contradiction avec les nôtres. Ceci pourrait être expliqué, outre la différence de modèle neuronal utilisé, par les conditions de culture. En effet, les auteurs ont utilisé un milieu de culture contenant 10% du sérum, du BDNF et du CNTF. De plus, ils ont cultivé les neurones sur des lamelles recouvertes de laminines. En revanche, j’ai utilisé la ploy-L-Lysine comme substrat d’attachement pour les cellules et le milieu de culture ne contenait pas de sérum (dont les neurotrophines qu’il contient pourraient moduler plusieurs mécanismes intracellulaires et affectant ainsi la croissance neuritique sans que l’on puisse estimer ces effets). Enfin, il a été démontré que les laminines favorisent la croissance neuritique plus que la poly-L-Lysine (Rangappa et al., 2000).
Pour finir une autre étude récente semble valider nos observations puisque (Dugani et al., 2010) ont montré que l’extinction de RSK2 induit un arrêt de la différenciation de cellules neuronales précurseur en neurones dans le cortex cérébral, en accord avec le concept d’une implication de RSK2 dans le développement neuronal.
3. Régulation de l’activité de PLD1 par RSK2 au cours de la croissance neuritique
L’implication de la PLD1 dans la fusion membranaire a été mise en avant par plusieurs groupes et dans différents modèles cellulaires (Voir l’introduction). Notre équipe a montré que la stimulation de l’exocytose régulée requiert l’activation de PLD1 par une phosphorylation dépendante de RSK2. Ce mécanisme semble contrôler l’étape finale de la fusion membranaire (Zeniou-Meyer et al., 2008). D’autre part, Zeniou-Meyer et al., (2007) ont montré une production de PA produit par la PLD1 au niveau de la membrane plasmique à proximité de structures granulaires apparemment arrimée ou docked.
Pour ma part, j’ai montré au cours de ma thèse que le NGF induit la phosphorylation/activation de PLD1 et la production de PA d’une manière dépendante de RSK2, et que ce mécanisme semble contrôler la fusion des vésicules Ti-VAMP nécessaire à l’expansion membranaire et la croissance neuritique, en accord avec le rôle critique de Ti-VAMP dans ce processus (Martinez-Arca et al., 2000, Martinez-Arca et al., 2001).
Le point qui reste le plus obscur est le mécanisme par lequel le PA joue ses différentes fonctions. Toutefois, il a été proposé que le PA puisse moduler la fusion membranaire via deux mécanismes distincts mais pas forcément complètement indépendant. Ainsi le PA pourrait modifier localement la topologie membranaire par l’induction d’une courbure négative au niveau des sites de fusion. Le PA pourrait également promouvoir le recrutement de protéines impliquées dans l’exocytose telles que la syntaxine-1 ou la PI4P5K (Ammar et al., 2013b). Ayant observé que la surexpression d’une sonde du PA Spo20-GFP inhibe la croissance neuritique des cellules PC12 stimulées par le NGF, il est probable que cette sonde masque le site de liaison au PA pour ses partenaires, inhibant ainsi l’interaction avec le PA et le recrutement de ses partenaires potentiels. Parmi ces derniers, je voudrais citer en particulier Ti-VAMP. En effet, les travaux du groupe du Dr Galli indiquent que le domaine Longin de Ti-VAMP lie le PA in vitro. Comme ce domaine Longin inhibe l’activité de Ti-VAMP (Martinez-Arca et al., 2000, Martinez-Arca et al., 2001), on peut imaginer que le PA produit par la PLD1 pourrait induire un changement conformationnel de ce domaine et ainsi promouvoir l’activation de Ti-VAMP. D’autre part, Alberts et al., (2006) ont montré que l’exocytose des vésicules Ti-VAMP est contrôlé par la GTPase Cdc42 qui elle même semble être recruté aux membranes par le PA (Alberts et al., 2006, Faugaret et al., 2011).
II. Régulation du développement de l’arborisation dendritique et la maturation