Les différentes étapes de l’exocytose

Avant de fusionner avec la membrane plasmique, une vésicule subit certaines étapes de maturation au cours desquelles elle acquière les propriétés nécessaires à la fusion membranaire.

1.1.1. L’arrimage des vésicules (Tethering and Docking)

C’est le contact physique initial entre la membrane vésiculaire et la membrane plasmique. Il est important pour la libération rapide de contenu vésiculaire. Ce contact est assuré, essentiellement, par les protéines d’accrochage et les protéines Rab-GTPase. Deux classes de protéines d’accrochage ont été identifiées : les protéines longues possédant des domaines Coiled-Coil et les multi-complexes (exemple : le complexe exocyste). Ces protéines d’accrochage lient les Rab et les protéines SNAREs. L’interaction des vésicules avec les Rab activées assure leur transport tout au long du cytosquelette et facilite ainsi leurs recrutement au niveau des sites d’exocytose (voir l’exemple GLUT4 Figure 7) (Cai et al., 2007, Brocker et al., 2010). L’arrimage des vésicules est également contrôlé par l’actine subcorticale, qui formerait une barrière physique empêchant le premier contact entre la vésicule et la membrane. La destruction de l’actine subcorticale par la latrunculine A augmente l’exocytose dans les cellules chromaffines (Trifaro, 2002) et dans les cellules β pancréatiques (Tomas et al., 2006). Il semble aussi que la protéine accessoire du complexe SNARE Munc-18 agisse sur l’actine subcorticale, pour favoriser l’arrimage des vésicules (Toonen et al., 2006, de Wit, 2010).

Figure 6: Représentation schématique de protéines majeures de l’exocytose et de la structure du complexe SNARE neuronal. Le complexe SNARE est composé par deux domaines indépendants

le « Core SNARE » et le domaine Habc de la syntaxin-1. Le core SNARE est toujours composé des trois hélices Q et une hélice R (3Q:R). Les t-SNARE fournissent les hélices Q, une de la syntaxine 1 et deux de la SNAP25, alors que la v-SNARE, VAMP2, fournit l’hélice R. VAMP2 contient un motif SNARE adjacent au domaine transmembranaire (TMR). La syntaxine 1 a une large région amino-terminale formée par un paquet de 3 hélices pliées spontanément (Habc), une région linker non pliée, un motif SNARE (H3) et un domaine TMR. SNAP-25 procède deux motifs SNARE liés entre eux par une région linker contenant des cystéines palmitoylés responsables de l’attachement de la protéine à la membrane plasmique. La synaptotagmine 1 est formée par deux domaines C2 liant le Ca²⁺ (C2A et C2B) et d’un domaine amino-terminal transmembranaire. La complexine est impliquée dans l’exocytose, principalement, via son hélice centrale et l’hélice accessoire adjacente. Munc-18 est composée des trois domaines, d1, d2 (a et b) et d3 (a et b). Munc-13 contient trois domaines liant le Ca²⁺ : C2A, C2B et C2C, un domaine liant RIM (RBD) à l’extrémité amino-terminale, un autre liant la calmoduline (CBD) adjacent au domaine C1 et un domaine homologue aux Munc (MUN-A, B, C et D).

1.1.2. L’amorçage de la fusion membranaire (Priming)

Cette étape reflète les processus moléculaires et cellulaires mais aussi membranaire (réorganisation de la composition lipidique de la membrane) qui rendent la vésicule apte à la fusion induite par une stimulation (Klenchin and Martin, 2000). Ces processus impliquent essentiellement les protéines SNAREs et leurs régulateurs :

Munc-18, Munc-13, et la Complexine (Martin, 2003), mais aussi des lipases et des inositol-kinases (Ammar et al., 2013b).

Cette étape est fortement dépendante de l’ATP. En effet, il semble que l’ATP est utilisé par la PIP5-Kinase pour produire le PIP2 au niveau des sites d’exocytose (Hay et al., 1995). De même, l’ATP pourrait être aussi utilisée par NSF dans l’étape nécessaire au désassemblage du complexe SNARE en cis converti en SNARE libres ou SNARE en trans. Ces molécules SNAREs libres pourront ainsi former un nouveau complexe cis (Sugita, 2008).

1.1.3. La fusion membranaire (Triggering)

En fonction du type cellulaire, la fusion membranaire est déclenchée soit par l’augmentation intracellulaire de [Ca²⁺] (Pang and Sudhof, 2010), d’AMPc (Szaszak et al., 2008), l’activation de protéines kinases (Zeniou-Meyer et al., 2008, Jewell et al., 2011) ou par un changement du potentiel membranaire (Zeniou-Meyer et al., 2007).

Dans les neurones, l’augmentation de la [Ca²⁺] intracellulaire est détectée par la synaptotagmine (Segovia et al., 2010) ou Doc-2 (Friedrich et al., 2010), qui vont permettre de déclencher la fusion dépendante des protéines SNAREs. L’énergie nécessaire à la fusion membranaire semble être fournie en partie par le superenroulement des domaines SNAREs (Figure 8). Cette étape est régulée par plusieurs protéines qui agissent directement sur les protéines SNAREs comme Munc-18a (Fisher et al., 2001, Jorgacevski et al., 2011), la Complexine (An et al., 2010) ou d’autres protéines qui affecteront l’ouverture du pore de fusion comme la sous unité V0 de la V-ATPase (El Far and Seagar, 2011).

Figure 7: L’exocytose des vésicules de stockage de Glut4 (GSV). En absence d’insuline, la

majorité de Glut4 est distribuée entre les endosomes, le réseau transgolgien, les vésicules de stockage de Glut4 (GSV), tandis que moins de 5% se trouve à la membrane plasmique. En réponse à une stimulation à l’insuline, le taux de Glut4 à la membrane plasmique augmente suite à l’exocytose des GSV. Ce processus se passe en trois étapes: i) Translocation de GSV suite à l’activation de la voie PI3K-AKT par le récepteur à l’insuline activé. AKT phosphoryle AS160 et inhibe son activité GAP, ce qui active les protéines Rab8, 10 et 14. L’insuline inhibe aussi l’interaction entre Glut4 et TUG ou

Tether containing UBX domain for Glut4-Ubiquitin like1, impliquée dans la rétention des GSV à la

région périnucléaire via son interaction avec Glut4, permettant ainsi aux GSV d’être transportées à la périphérie cellulaire grâce aux microtubules. Ce transport est facilité par l’interaction entre la protéine moteur MYO1C et la GTPase Ral-A vésiculaire. A la périphérie cellulaire, le mouvement des GSV est contrôlé par l’actine subcorticale. ii) L’attachement de GSV à la membrane plasmique est assurée par le complexe exocyste. En effet, l’insuline stimule l’interaction entre la Rho-GTPase TC10, et la sous unité du complexe exocyste EXO70 favorisant la formation du complexe. L’interaction de GSV avec ce complexe est gouvernée par Sec5 et Ral-A dont l’activité est régulée par RGG1 et RGG2 sous la dépendance d’AKT. Après l’attachement de la vésicule à la membrane plasmique, le désassemblage du complexe exocyste est induit par la phophorylation de RalA par la PKC. iii) La fusion de GSV avec la membrane plasmique gouvernée par le complexe SNARE comprenant VAMP2, syntaxine 4 et SNAP23. L’assemblage du complexe SNARE est contrôlé par l’insuline. En effet, le récepteur à l’insuline catalyse la phosphorylation de Munc18-C sur les résidus Tyr219/521, favorisant ainsi son interaction avec Doc2β, impliquée dans l’augmentation de la courbure membranaire (Martens, 2010). L’interaction entre Doc2β et Munc-18 empêche ainsi l’inhibition de la syntaxine 4 par la Munc18-C. L’insuline inhibe aussi l’interaction inhibitrice de la syntaxine 4 avec la Synip (STXBP4) et la tomosyne (SYNBP5). AKT phosphoryle et recrute la CDP138 ou uncharacterized 138 kDa C2 domain-containing

phosphoprotein à la membrane plasmique pour promouvoir la fusion de la GSV (Leto and Saltiel,

Figure 8: Représentation schématique de la fusion membranaire induite par le complexe SNARE. Munc-18 lie la syntaxine-1 et masque son site d’interaction avec les autres protéines SNARE

(A). La stimulation de l’exocytose induit la dissociation de Munc18 et syntaxine-1. Cette dernière adoptera alors une conformation favorisant l’interaction avec les autres protéines du complexe SNARE, via leurs motifs SNARE formant ainsi un domaine coiled-coil (B-C). La formation du complexe SNARE initie le rapprochement des deux membranes et puis la formation du pore de fusion et la fusion membranaire dépendante de l’énergie fournie par ce complexe (C-D).