Implication de la PLD1 dans le trafic vésiculaire et l’exocytose

Plusieurs études ont montré que la stimulation des cellules endocrines avec un sécrétagogue augmente l’activité PLD en parallèle de la sécrétion. Ceci suggère une implication de la PLD1 et/ou de la PLD2 dans la sécrétion. En effet, il a été démontré que la stimulation de la lignée des cellules β-pancréatiques MIN6 avec le glucose induit la libération d’insuline qui est accompagnée par une augmentation de l’activité PLD et plus spécifiquement de l’activité de la PLD1, puisque cette lignée n’exprime

avec le 1-butanol (qui bloque la production de PA en formant un phosphatidylalcool) ou la surexpression d’un mutant catalytiquement inactif PLD1(K898R) réduit la translocation des vésicules d’insuline et leur libération (Hughes et al., 2004). Dans ces cellules, l’activation de la PLD1 en réponse au glucose est induite par Arf6. La PLD1, ainsi activée, induit la phosphorylation de mTOR et de sa cible p70S6K ou S6K. L’activation de la voie mTOR-S6K est impliquée dans la régulation de l’expression de Beta-2, un régulateur de la transcription du gène d’insuline et de la sécrétion de l’insuline. Ainsi l’inactivation d’Arf6 par le Bréfeldine A réduit l’activité de la PLD1 et en conséquence réduit l’expression de Beta-2 et la sécrétion de l’insuline (Ma et al., 2010). Un rôle direct de la PLD1 dans la fusion des vésicules d’insuline a aussi été proposé. En effet, la surexpression de la PLD1 dans les cellules 3T3L1 augmente la localisation du transporteur du glucose Glut4 à la membrane plasmique, suite à une stimulation par l’insuline. Cet effet est bloqué par le mutant inactif de PLD1(K898R) ou par l’extinction de la PLD1 (Huang et al., 2005). Le traitement des cellules avec de la lysophosphatidylcholine (LPC) qui induit une courbure membranaire positive de la membrane externe, restore la localisation de Glut4 à la membrane plasmique en absence de l’activité de PLD1, suggérant que la PLD1 est impliquée dans l’étape finale de la fusion membranaire (Huang et al., 2005). L’implication de la PLD1 dans une étape finale de l’exocytose a également été démontrée par notre équipe dans les cellules chromaffines et les cellules PC12, parce que le LPC restore la sécrétion en absence de PLD1 (Zeniou-Meyer et al., 2007).

La PLD1 joue également un rôle dans le trafic des vésicules contenant la GTPase Rap1 et dans sa localisation à la membrane plasmique (Mor et al., 2009). En effet, le traitement des cellules Jurkat T avec le 1-butanol inhibe la translocation des vésicules Rap1 à la membrane plasmique induite par la stimulation du récepteur des cellules T ou TCR (T cell receptor). Ces vésicules Rap1 contiennent aussi la PLD1. Il semble que la PLD1 contrôle la livraison des vésicules Rap1 à la membrane plasmique, où cette dernière sera activé par la G3G, une GEF activée par le TCR contrôlant l’adhésion cellulaire (Mor et al., 2009).

L’implication de la PLD1 et de son produit le PA dans la libération des contenues vésiculaires a aussi été démontrée dans les cellules endothéliales, où la stimulation par l’histamine induit la libération du facteur VWF (Von Willebrand factor) et en

parallèle une augmentation de l’activité de la PLD1 et la production de PA à la membrane plasmique (Disse et al., 2009). Le traitement des cellules avec le 1-butanol ou l’extinction de la PLD1 inhibe la sécrétion du facteur VWF induite par l’histamine.

D’autres études ont montré également l’implication de PLD1 dans la neurosecrétion. Humeau et al (2001) ont montré qu’une forme proche de la PLD1 est impliquée dans la libération d’acétylcholine par les neurones d’Aplysie (Humeau et al., 2001). D’autre part, la surexpression de PLD1-GFP dans des neurones d’hippocampe augmente la sécrétion de la serine protéase le tPA (Tissue plasminogen activator), induite par la forskoline ou l’ionophore calcique A23187. Ceci conduit également à augmenter la longueur des neurites (Zhang et al., 2005). Ces auteurs ont proposé que la PLD1 stimule la croissance neuritique en favorisant la libération de tPA.

La PLD1 est aussi impliquée dans le trafic des vésicules contenant APP (Amyloid

Precursor Protein). En effet, la PLD1 joue un rôle important dans la formation et le

transport des vésicules contenant APP à partir du réseau transgolgien vers la membrane plasmique. La localisation membranaire d’APP est essentielle pour induire son rôle dans la formation des synapses, la guidance de l’axone et la croissance neuritique. La surexpression de PLD1 restore la croissance et le branchement neuritique en absence de la préseniline-1 (PS1), une sous unité de la γ-sécrétasse impliquée dans le clivage d’APP en Aβ. En effet, cette surexpression augmente la production de PA et ainsi le trafic des vésicules APP en absence de PS1 (Cai et al., 2006). Pour finir, la PLD1 augmente aussi l’expression de PS1 à la membrane plasmique en absence d’APP. Cette augmentation est dépendante de l’activité de PLD1 (Liu et al., 2009).

1.1. Régulation de l’activité de la PLD1 pendant l’exocytose

Au cours de la stimulation de l’exocytose dans les cellules neuroendocrines, l’activité de PLD1 est stimulé par la phosphorylation de sa thréonine 147 par la kinase RSK2 (Zeniou-Meyer et al., 2007). D’autre part, cette phosphorylation augmente la production de PA à la membrane plasmique nécessaire à la sécrétion hormonale

chromaffines, est aussi régulée par ARF6 et son facteur d’échange ARNO (Vitale et al., 2001, Vitale et al., 2002a, Vitale et al., 2002b, Begle et al., 2009). L’extinction d’ARF6 mais pas celle d’ARF1 réduit l’activité PLD induite par la stimulation de 60-70% et le recrutement à la membrane plasmique de Spo20-GFP, une sonde spécifique du PA. La production de PA à la membrane est PLD1 dépendante puisque seul l’extinction de la PLD1 bloque le phénomène, tandis que l’extinction de la PLD2 n’a pas d’effet (Begle et al., 2009).

Liu et al (2005) ont montré que SCAMP2, une protéine transmembranaire impliquée dans l’étape finale de la fusion, est impliquée dans le recrutement d’ARF6 à la membrane plasmique en réponse à la stimulation des cellules PC12 (Liu et al., 2005). Ceci est en accord avec les travaux de notre équipe qui ont montré pour la première fois qu’Arf6 est recruté des granules de sécrétion vers la membrane plasmique en réponse à une stimulation (Vitale et al., 2002a, Vitale et al., 2002b). Ainsi, il semble que SCAMP2 joue un rôle dans le recrutement et le rapprochement de PLD1 et d’ARF6, activée par ARNO, au niveau de site de fusion, où les quatre protéines colocalisent (Figure 22).

Figure 22: Modèle proposé de la régulation de PLD1 par Arf6 et ARNO lors de l’exocytose.

(Adapté de Liu et al., 2005).

De plus, la GTPase Rac1 est impliquée dans l’activation de la PLD1 et la production du PA au cours de la sécrétion hormonale dans les cellules PC12, mais pas RhoA ou Cdc42 (Momboisse et al., 2009). D’autre part, βPix permet l’activation de Rac1 et

induit la production de PA via la PLD1 au niveau de site d’exocytose favorisant ainsi la libération hormonale (Momboisse et al., 2009). βPix est recrutée à la membrane plasmique par le facteur suppresseur de tumeur Scribble via son domaine PDZ (Audebert et al., 2004).

La PKC semble aussi être impliquée dans la régulation de l’activité de PLD1 au cours de la libération hormonale, puisque la surexpression du mutant PLD1-PIM87, qui ne répond pas à la PKC, augmente la libération hormonale mais plus faiblement que la forme sauvage de la PLD1 (Vitale et al., 2001).

Enfin, la GTPase RalA est également impliquée dans l’exocytose des cellules chromaffines où elle stimule l’activité de la PLD1 de mannière synergique avec Arf6 (Vitale et al., 2005). Des observations similaires ont été faites sur les cellules β-pancréatiques (Lijubicic et al., 2009). Dans ces cellules, RalGDS permet l’activation de RalA et ainsi son interaction avec le domaine amino-terminal de la PLD1 favorisant ainsi l’exocytose (Lijubicic et al., 2009).

1.2. Dynamique et fonction du PA pendant de l’exocytose

Afin d’étudier la dynamique de la production de PA lors de l’exocytose régulé, Zeniou-Meyer et al (2007) ont utilisé Spo20-GFP comme une sonde spécifique du PA. Ils ont montré par microscopie à onde évanescente, que la sonde Spo20-GFP est recrutée à la membrane plasmique suite à une stimulation de la sécrétion avec une cinétique extrêmement semblable à l’activité sécrétrice mesurée en parallèle par ampérométrie. L’étude ultra structurale des cellules transfectées avec cette sonde a montré en outre que le PA est produit à la périphérie cellulaire, probablement au niveau de la membrane plasmique et/ou au niveau des granules de sécrétion arrimés aux sites d’exocytose.

Pour résumer, le rôle potentiel de la PLD1 dans l’étape finale de la fusion membranaire semble dû à son produit le PA. Ce phospholipide pourrait moduler la fusion par au moins trois mécanismes distincts. Le PA pourrait stimuler le recrutement et l’activité de protéines de la machinerie d’exocytose telle que la

comme le PA et le PIP2 (Lam et al., 2008). Le PA peut également modifier la topologie membranaire en favorisant localement une courbure membranaire négative du feuillet interne de la membrane plasmique (Figure 23, chapitre précédent et Ammar et al., 2013b). Enfin, le PA peut être transformé en d’autres lipides de signalisation comme le DAG qui peuvent également recruter et activer certaines protéines associées au complexe SNARE.

Figure 23: Modèle proposé pour le rôle fusiogénique du PA lors de l'exocytose. Au cours de

l’étape finale de l’exocytose, l’activation de la PLD1 induit la production de PA au niveau des sites d’exocytose. L’accumulation de PA au niveau de la membrane plasmique facilite une courbure négative. D’autre part, le LPC facilite une courbure positive de la membrane grâce à sa forme conique inverse, ce qui permet d’expliquer qu’il puisse restorer l’activité sécrétrice en absence de PLD1. Adapté (Cazzolli et al., 2006).