Colocalisation de PLD1, RSK2 et ERK1/2 au niveau de structures vésiculaires 104

Les résultats précédents montrent que la PLD1 régule l’activation de la voie ERK1/2-RSK2-CREB en réponse au traitement des cellules avec des neurotrophines. J’ai donc cherché à voir si ces protéines sont localisées au même endroit dans les neurones. D’une manière intéressante, PLD1-GFP colocalise partiellement avec phospho-ERK1/2, puisque j’ai pu mesurer un taux de colocalisation de 67% ±2.35% après un traitement de 15 min au BDNF. Ces deux protéines colocalisent principalement au niveau de structures ponctiformes présentent dans le corps cellulaires, mais également dans les prolongements (Figure 40). En plus, j’ai pu observer que HA-RSK2 colocalise aussi avec PLD1-GFP et phospho-ERK1/2 au

niveau de ces structures ponctiformes avec un taux de colocalisation de 23% ± 3.12% (Figure 40).

Figure 40: Colocalisation vésiculaire partielle entre PLD1-GFP, phospho-ERK1/2 et HA-RSK2.

Des neurones corticaux ont été co-transfectées à 2 DIV avec PLD1-GFP et HA-RSK2. 24H après, les cellules ont été stimulées ou pas par le BDNF pendant 15 min. Après fixation les cellules ont été marquées avec un anti-phospho-ERK1/2, révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-647 et un anti-HA révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-555. Bar= 25µm.

5. BDNF induit la formation d’un complexe entre PEA15, ERK1/2, RSK2 et PLD1

Il a été précédemment démontré que la protéine PEA15 ou phosphoprotein enriched

in astrocytes interagit avec PLD1 (Zhang et al., 2000b, Viparelli et al., 2008, Doti et

al., 2010, Farina et al., 2013), ERK1/2 (Formstecher et al., 2001, Hill et al., 2002) et RSK2 (Vaidyanathan and Ramos, 2003, Vaidyanathan et al., 2007). La PLD1 interagit avec la partie amino-terminale de PEA15, tandis qu’ERK1/2 et RSK2 se lient à la partie carboxy-terminale (Figure 41).

Figure 41: Représentation des principaux domaines de PEA15, ainsi que des sites de liaison d'ERK1/2, de PLD1 et de RSK2.

Ainsi cette protéine apparait comme un candidat intéressant pour servir de matrice à la formation d’un complexe entre les trois protéines. Afin de vérifier cette hypothèse, j’ai réalisé une co-immunoprécipitation à partir de cultures neuronales traitées ou pas avec le BDNF. Au repos, PEA15 ne co-immunoprécipite pas les trois protéines recherché (Figure 42). En revanche, la stimulation des cellules pendant 15 min avec du BDNF semble induire la formation d’un complexe entre PEA15 et ERK1/2, RSK2 et PLD1, puisque les trois protéines coprécipitent avec PEA15 (Figure 42).

Figure 42: Le BDNF induit la formation d’un complexe protéique contenant ERK1/2, RSK2, PLD1 et PEA15. Des neurones (3DIV) ont été traités ou pas par le BDNF pendant 15 min. Une

immunoprecipitation par un anticorps dirigé contre PEA15 a été réalisée. La co-immunoprécipitation de PLD1, RSK2 et ERK1/2 a été testé. GAPDH a été utilisé comme un contrôle négatif d’IP.

5. Localisation endosomale de PLD1 et d’ERK1/2

Afin de déterminer l’identité les structures ponctiformes où colocalisent PLD1 et phospho-ERK1/2, j’ai réalisé une série d’immunomarquages des neurones en culture ou des cellules PC12, ainsi que des fractionnements subcellulaire en utilisant un gradient d’OptiPrep. En utilisant, APPL1 comme marqueur des endosomes précoces et Rab7 comme marqueur des endosomes tardifs, j’ai pu observer que 15.3% ±1.67% de PLD1-GFP colocalise avec les endosomes précoces après 15 min de traitement au BDNF et que 30% ±2.56% de PLD1-GFP colocalise avec les endosomes tardifs après 15 min de traitement au BDNF. En revanche, après une heure de traitement par le BDNF 67% ±3.23% de PLD1-GFP colocalise avec Rab7

(Figure 43). IL semble donc qu’un traitement au BDNF augmente le niveau de PLD1 associé aux endosomes tardifs.

Figure 43: Localisation endosomale de PLD1-GFP. Des neurones corticaux ont été transfectées à

2 DIV avec PLD1-GFP. 24H après, les cellules ont été stimulées ou pas par le BDNF pendant 15 min ou 60 min. Après fixation les cellules ont été marquées avec un anti-APPL1 ou un anti-Rab7, révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-555. Bar= 25µm.

De même, j’ai montré que phospho-ERK1/2 colocalise partiellement avec PLD1-GFP et Rab7 (Figure 44).

Afin de confirmer la localisation de PLD1, ERK1/2, RSK2 et PEA15 dans le système endosomal, j’ai réalisé un fractionnement sur un gradient d’OptiPrep (5%, 10%, 15%, 20% et 25%), réalisé à partir d’une culture neuronale traitée au BDNF pendant 15

récepteur au BDNF (TrKB), les marqueurs d’endosome précoce : APPL1/Rab5, phospho-ERK1/2 et PEA15 (Figure 44).

Figure 44: Localisation endosomale de PLD1, d’ERK1/2, RSK2 et de PEA15. (A) Des neurones

corticaux ont été transfectées à 2 DIV avec un plasmide codant la PLD1-GFP. 24H après, les cellules ont été stimulées ou pas par le BDNF pendant 15 min. Après fixation les cellules ont été marquées avec un anti-phospho-ERK1/2, révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-647 et un anti-Rab7, révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-555. Les flèches montrent certains points de colocalisation entre le trois marqueurs. Bar= 25µm. (B) Fractionnement subcellulaire d’un lysat de neurones corticaux traités au BDNF séparé sur un gradient d’OptiPrep (5%, 10%, 15%, 20% et 25%). Les fractions ont été testées par western-blot avec les anticorps indiqués.

Au niveau des cellules PC12 traitées au NGF, PLD1-GFP colocalise aussi avec Rab7 et phospho-ERK1/2 dans des structures vésiculaires et périnucléaires (Figure 45). En plus, PLD1-GFP colocalise avec phospho-ERK1/2 à la périphérie cellulaire (Figure 45).

Figure 45: Colocalisation membranaire et endosomale de PLD1-GFP et de phospho-ERK1/2 induite par le NGF. Des cellules PC12 ont été transfectées avec un plasmide codant la PLD1-GFP.

24H après, les cellules ont été stimulées par le NGF. Après fixation les cellules ont été marquées avec un phospho-ERK1/2, révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-647 et un anti-Rab7, révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-555. Bar= 25µm.