La surexpression de PLD1 induit une augmentation de la phosphorylation

Afin de confirmer l’implication de la PLD1 dans la régulation de la voie ERK1/2-RSK2-CREB, j’ai choisi de surexprimer PLD1-GFP dans des neurones corticaux en culture. Les neurones surexprimant PLD1-GFP présentent une augmentation de phospho-ERK1/2 nucléaire de 2 fois par rapport aux cellules non transfectées dans les conditions de repos (Figure 36). Une stimulation par le BDNF pendant 15 min augmente de 5 fois le taux de phospho-ERK1/2 nucléaire pour les cellules contrôles. En revanche, dans le cas des neurones exprimant PLD1-GFP cette augmentation est de 10 fois (Figure 36). En résumé, les neurones surexprimant la PLD1 présente un niveau plus élevé de phospho-ERK1/2 nucléaire et ce niveau augmente encore d’avantage en réponse au BDNF.

D’une manière intéressante, la totalité des neurones surexprimant PLD1-GFP présente en outre d’une augmentation de phospho-ERK1/2 nucléaire une augmentation du taux de phospho-ERK1/2 cytosolique. Ceci est particulièrement visible au niveau périnucléaire et neuritique. Cette augmentation semble être spécifique de la PLD1 puisque la surexpression d’HA-RSK2 ou de la GFP seule n’induit pas l’augmentation de phospho-ERK1/2 (Figure 36).

D’une manière surprenante, la surexpression d’HA-RSK2 n’affecte pas la phosphorylation nucléaire d’ERK1/2 (Figure 36). En effet, on aurait pu s’y attendre puisqu’il a été établi précédemment que RSK2 régule négativement la phosphorylation d’ERK1/2 via la phosphorylation et l’inhibition de SOS (Clark et al., 2007). En outre, nous observons ici que la co-expression d’HA-RSK2 avec PLD1-GFP n’affecte par l’augmentation de phospho-ERK1/2 induite par PLD1-PLD1-GFP (Figure 36).

En outre, la surexpression de PLD1-GFP augmente également le taux de phospho-CREB nucléaire. Cette augmentation est voisine de 30% par rapport aux neurones non transfectés 15 min après stimulation au BDNF (Figure 37).

Figure 37: Augmentation du taux de phospho-CREB nucléaire dans les neurones surexprimant PLD1-GFP. Des neurones corticaux ont été co-transfectées à 2 DIV avec PLD1-GFP. 24H après les

cellules ont été stimulées ou pas par le BDNF pendant 15 min. Après fixation les cellules ont été marquées avec un anti-phospho-CREB, révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-555. Le taux de phospho-CREB nucléaire a été normalisé par rapport à la surface nucléaire révélée par DAPI. Bar= 25µm.

Dans un deuxième temps, j’ai transfecté des cellules PC12 afin de pouvoir valider ces résultats par une analyse par western blot après traitement des cellules au NGF. Comme montré précédemment le NGF induit une phosphorylation rapide d’ERK1/2, qui est maintenue jusqu’à une heure (Ammar et al., 2013a). En outre, en accord avec nos résultats précédent, cette stimulation par le NGF induit aussi la phosphorylation de RSK2, ainsi qu’une augmentation au cours du temps de la phosphorylation de PLD1 (Thr-147) (Figure 38). De manière remarquable cette augmentation du niveau de phospho-PLD1 a pu être observée sur la PLD1 surexprimée (Figure 38, faible exposition), mais aussi sur le PLD1 endogène (Figure 38, forte exposition). Mes résultats antérieurs indiquent que la phosphorylation de la PLD1 suite à la stimulation au NGF est RSK2 dépendante (Ammar et al., 2013a). En outre, le NGF induit aussi la phosphorylation de CREB sur Ser-133 dans les cellules PC12 (données non

présenté), et cette phosphorylation est maximale après 15 min de traitement au NGF (Figure 38).

Figure 38: Augmentation de l'activation de la voie MAPK (ERK1/2-RSK2-CREB) dans les cellules PC12 surexprimants PLD1-GFP et traitées par le NGF. Des cellules PC12 ont été

transfectées avec un plasmide codant PLD1-GFP ou GFP seule. 24h après, les cellules ont été stimulées ou pas par le NGF pendant des différents temps (5’, 15’ et 60’). Le taux de phospho-protéine a été déterminé par rapport au taux d’expression de la phospho-protéine non phosphoryle puis normalisée par rapport au niveau d’expression de GAPDH. La quantification du taux de phospho-PLD1 (Thr-147) regroupe phospho-PLD1 endogène et phospho-PLD1-GFP. Quantification réalisée sur trois expériences différentes. * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001.

La surexpression de PLD1-GFP induit une augmentation de 40% du niveau de phospho-ERK1/2 après une heure de traitement par le NGF, en comparaison des cellules exprimant la GFP (Figure 38). Ceci suggère que la PLD1 pourrait être impliquée dans le maintien de la phosphorylation d’ERK1/2 au cours du temps. D’une manière intéressante, la surexpression de PLD1-GFP induit une augmentation du taux de phospho-RSK2 et de phospho-CREB 5 min, 15 min et 60 min après stimulation au NGF par rapport aux cellules surexprimant la GFP (Figure 38). Ces résultats semblent bien confirmer l’implication de la PLD1 dans la régulation de la voie ERK1/2-RSK2-CREB, suite à la stimulation des cellules avec une neurotrophine. Cette régulation semble être due à l’activité de la PLD1 qui produit du PA. En effet, la transfection des cellules PC12 avec la sonde Spo20-GFP qui se fixe sur le PA réduit

transfectées ou surexprimant la GFP (Figure 39). A ce propos, je voudrais rappeler que j’ai montré que la transfection des cellules PC12 avec la sonde Spo20-GFP inhibe également la croissance neuritique induite par le NGF (Ammar et al., 2013a). Ceci suggère donc que la sonde Spo20-GFP en se liant au PA inhibe l’interaction d’une ou plusieurs protéines impliquées dans l’activation de la voie ERK1/2-RSK2-CREB. Un candidat potentiel comme cible du PA dans ce processus pour être la GTPase Raf.

Figure 39: Réduction de phospho-CREB nucléaire induite par NGF dans les cellules PC12 surexprimants GFP. Des cellules PC12 ont été transfectées avec un plasmide codant

Spo20-GFP ou Spo20-GFP seule. 24h après, les cellules ont été stimulées ou pas par le NGF pendant 15 min. Le taux de phospho-CREB a été normalisé par rapport à la surface nucléaire. Bar= 25µm. ** p≤0.01.

4. Colocalisation de PLD1, RSK2 et ERK1/2 au niveau de structures