Diminution de l’activation de la voie ERK1/2-RSK2-CREB et mTOR-S6K induite

La stimulation des neurones corticaux sauvages en culture par le BDNF induit une phosphorylation rapide d’ERK1/2 qui augmente au cours du temps (Figure 32). En revanche, même si le BDNF induit la phosphorylation d’ERK1/2 en absence de PLD1, cette augmentation est moins forte que celle observée dans le cas des neurones sauvages. Après quantification, nous observons une réduction de phospho-ERK1/2 de 44.33% ±5.25% (Figure 32). Ceci montre l’importance de la PLD1 dans l’activation et le maintien de la phosphorylation d’ERK1/2 au cours du temps.

En revanche, en absence de RSK2, le taux de phosphorylation d’ERK1/2 augmente par rapport aux neurones sauvages et cette augmentation est maintenue jusqu’à 30 min de traitement par le BDNF. Etant donné que RSK2 phosphoryle et active la PLD1 suite à la stimulation des cellules PC12 par le NGF (Ammar et al., 2013a), ces résultats suggèrent que l’implication de la PLD1 dans l’activation et le maintien de la phospho-ERK1/2 est indépendante de RSK2.

Figure 32: Implication de la PLD1 dans le maintien de la phosphorylation d’ERK1/2 induite par le BDNF. Des neurones corticaux sauvages ou Pld1-/- ou Rsk2-/- en culture (3DIV) ont été traités par

le BDNF (100ng/ml) pendant différents temps. Puis les cellules sont lysées et 35 µg des protéines ont été déposées et migrées sur gel SDS-PAGE. Après transfert, les protéines ont été révélées par l’application des anticorps spécifiques ERK1/2, anti phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) et anti-GAPDH. Le taux de phospho-ERK1/2 a été déterminé par rapport au taux d’ERK1/2 totale, puis normalisé par rapport à l’expression de GAPDH. La phosphorylation de phospho-p42 (ERK1) et phospho-p44 (ERK2) est normalisée par rapport aux neurones non traités. Quantification réalisée sur trois expériences différentes.

Figure 33: Implication de la PLD1 dans la phosphorylation de RSK2 induite par le BDNF. Des

neurones corticaux sauvages ou Pld1-/- ou Rsk2-/- en culture (3DIV) ont été traités comme indiqué t pRSK2 estimés. * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001.

D’une manière intéressante, l’absence de PLD1 réduit également la phosphorylation de RSK2 induite par un traitement de 15 min au BDNF. Cette réduction est d’environ 50% par rapport au niveau de pRSK2 mesuré dans les neurones Pld1+/+ (Figure 33).

D’autre part, le taux de phosphorylation de CREB sur Ser-133 est réduit de 66% ± 0.7% chez les neurones Pld1-/-, par rapport aux neurones Pld1+/+ (Figure 34), alors qu’en absence de RSK2 le taux de phosphorylation de CREB n’est réduit que de 33% ± 1.6%.

Figure 34: Implication de la PLD1 dans la régulation de l'activité de CREB et mTOR. Des

neurones de chaque génotype (3DIV) ont été traités ou pas par le BDNF pendant 15 min. Le taux de phospho-protéine a été déterminé par rapport au taux d’expression de GAPDH. Quantification de trois expériences différentes où la phosphorylation est normalisée par rapport aux neurones non traités. LE : faible exposition, HE : forte exposition * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001.

Le BDNF induit aussi une légère augmentation du niveau de phosphorylation de mTOR sur Ser2448 après 15 min d’incubation (Figure 34). Cette augmentation est complètement inhibée en absence de PLD1 (Figure 34). Par contre les constatations faites en absence de RSK2 ne permettent pas d’obtenir de différence significative

entre les conditions, en raison d’une trop grande variabilité des résultats (Figure 34). Par ailleurs, nous avons pu observer que la phosphorylation de la S6K sur Thr139 (le substrat de mTOR) est complètement inhibée en absence de PLD1 (Figure 34).

Il a été rapporté que le traitement des neurones avec le BDNF induit une augmentation de phosphorylation d’ERK1/2 et de CREB au niveau nucléaire (Zhou et al., 2011, Kim et al., 2012). Afin de vérifier si le taux de phosphorylation nucléaire de ces deux protéines est altéré en absence de PLD1, j’ai quantifié l’intensité de la fluorescence de p-CREB et p-ERK1/2 15 min après stimulation par le BDNF. Le taux de fluorescence rapporté à la surface nucléaire montre que le taux de phospho-CREB est réduit de 50% dans les neurones Pld1-/-, alors que celui d’ERK1/2 ne diffère pas dans les deux génotypes (Figure 35). Ceci suggère que la PLD1 contrôle la phosphorylation nucléaire de CREB et la phosphorylation cytoplasmique d’ERK1/2.

Figure 35: Réduction du taux de phospho-ERK1/2 cytosolique et de phospho-CREB nucléaire des neurones traités par le BDNF en absence de la PLD1. A) Des neurones en culture (3 DIV) ont

été traités 15 min par le BDNF. Après fixation, les neurones ont été marqués avec un anticorp anti-β tubuline, tandis que le taux de phospho-CREB ou pERK1/2 (non présenté ici) est révélé par un anticorp anti-p-Ser133 de CREB. (B) Quantification du taux nucléaire de la phospho-ERK1/2 ou CREB. L’intensité du marquage a été normalisée par rapport à la surface nucléaire. (C) Réduction de

Pour vérifier cette hypothèse, j’ai réalisé un fractionnement subcellulaire pour séparer la fraction cytosolique de la fraction nucléaire. L’analyse du taux de phosphorylation d’ERK1/2 confirme bien la réduction cytosolique de phospho-ERK1/2 15 min après stimulation au BDNF (Figure 35).

Figure 36: Augmentation de taux de phospho-ERK1/2 dans les neurones corticaux en culture surexprimant PLD1-GFP. Des cellules ont été co-transfectées à 2 DIV avec PLD1-GFP et HA-RSK2.

24H après les cellules ont été stimulées ou pas par le BDNF pendant 15 min. Après fixation les cellules ont été marquées avec un anti-phospho-ERK1/2, révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-647 et un anti-HA révélé par un anticorps secondaire couplé à l’Alexa Fluor-555. Le taux de phospho-ERK1/2 nucléaire a été normalisé par rapport à la surface nucléaire révélée par DAPI. Bar= 25µm.

3. La surexpression de PLD1 induit une augmentation de la phosphorylation