Le CTD de la RNAPII est impliqué dans le recrutement de nombreux facteurs de maturation de l’ARN pré-messager (cf. intro). Pour savoir si l’ARN U1 pourrait être enrichi au site de transcrip-tion via le CTD de la RNAPII, des analyses d’images ont été faites avec une RNAPII dont le CTD ne comporte que 5 répétitions (RNAPII-∆5) [96]. Cette RNAPII possède une étiquette GFP en C-terminal de la sous-unité Rpb1 et surtout une mutation ponctuelle qui lui confère une résistance à l’α-amanitine [139]. Les cellules ont été transfectées soit avec la RNAPII-GFP sauvage, soit avec la RNAPII-∆5. En présence d’α-amanitine, la RNAPII endogène est bloquée et la cellule ne pos-sédant pas la RNAPII résistante meurt [222, 267, 102]. La RNAPII-∆5 est capable de transcrire un gène inséré en multicopies dans un génome [210].
Après un traitement à l’α-amanitine de 4h à 100µg/mL, les cellules n’ayant pas été transfectées sont en train de mourir et ne présentent aucun site de transcription. Les cellules fixées sont analy-sées en FISH contre l’ARN U1. Le signal GFP donne la localisation de la sous-unité Rpb1. Celle-ci, après un tel traitement, se trouve dans le noyau et dans le cytoplasme. En effet, il y a sans doute plus de sous-unités Rpb1 produites que de complexes RNAPII possibles et la sous-unité Rpb1 ne possède pas de signal de rétention nucléaire. Ce patron est légèrement différent entre la Rpb1 sau-vage et la Rpb1-∆5. En effet, on voit un signal plus nucléaire pour la Rpb1 sauvage. Néanmoins, le signal GFP reste très faible dans les deux cas. Il faut remarquer que les cellules présentant un fort signal GFP, et donc une forte expression, sont toutes en apoptose. Une trop forte expression de Rpb1 muté ou non entraîne donc un état trop fortement perturbé pour la cellule. D’autre part, la proportion de cellules en apoptose est beaucoup plus importante dans le cas de la transfection avec la sous-unité Rpb1-∆5. Il est évident qu’un CTD tronqué empêche la cellule de produire des ARNm matures et donc conduit la cellule à la mort [45].
Par un FISH sur l’ARN U1, on a regardé son enrichissement au site en fonction du type de RNA-PII transfectée. Les premiers résultats ne sont pas très concluants comme le montre la figure 6.11.
On voit un recrutement positif de l’ARN U1 avec la RNAPII sauvage résistante à l’α-amanitine sur la lignée WT (figure 6.11 Aa). Cependant, les valeurs mesurées sont très faibles. L’enrichissement
6.5. Rôle du CTD de la RNAPII dans l’enrichissement du snARN U1 au site de transcription 139
de l’ARN U1 est significatif dans la lignée WT mais peu dans la lignée MUT (voir annexe A sur les résultats significatifs). En revanche, il n’y a aucune différence entre le site de transcription et un site contrôle lorsqu’on utilise la RNAPII∆5, quelle que soit la lignée observée (figure 6.11 Ab). Il est difficile de porter du crédit à ces premières expériences car il y a très peu de RNAPII au site de transcription comme on le constate sur la figure 6.11 B. D’une façon générale, le signal GFP est très faible dans la cellule et il y a peu de différence entre le site de transcription et un site contrôle.
On peut d’ailleurs remarquer que le signal U1 obtenu dans la lignée WT avec le CTD intégral, seul résultat significatif, correspond au signal GFP le plus fort. La faible concentration de RNAPII-GFP n’empêche pas la production d’ARNm comme le présente la figure 6.11 C. Les densités de signaux ARNm sont comparables à ce qu’on trouve dans les autres expériences (la différence d’échelle pro-vient de du type d’image analysée : de 1 à 10 000 en 16 bits et de 1 à 500 en 8 bits). Cette expérience doit être renouvelée avec comme contrôles, les autres snARNs de l’épissage pour étudier leur com-portement avec la RNAPII∆5. L’ARN U2 ou la tri-snRNP ne sont en effet pas recrutés sur le gène sans intron. Les densités obtenues nous permettront de comparer avec l’ARN U1. Si on ne peut conclure sur le rôle du CTD à travers cette expérience, on peut tout de même dire que l’ARN U1 n’est pas recruté par l’ARNm puisque dans la lignée MUT avec la RNAPII GFP sauvage, la densité de signal MS2 est très forte et pourtant le recrutement de l’ARN U1 n’est pas significatif. L’ARN U1 n’est donc définitivement pas enrichi sur un site de transcription sans épissage par une hybrida-tion persistante avec un site donneur sur l’ARNm.
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FIGURE6.11 –Expression d’une RNAPII-CTD-GFP ou RNAPII-∆5-GFP dans les lignées MUT et WT.Analyse sur l’ARN U1. Les cellules ont été transfectées avec la construction Rpb1-wtCTD ou Rpb1-∆5CTD, puis traitées à l’α-amanitine et induites à la doxycycline. Après avoir été fixées, un FISH contre les répétitions MS2 et contre l’ARN U1 a été réalisé. Les images obtenues ont fait l’objet d’une analyse radiale. Les figures (a) représentent les transfections RNAPII-CTD-GFP et les figures (b), les transfections RNAPII-∆5-GFP. A. Densité de signal U1 au site de transcription et aux sites contrôles. B. Densité de signal GFP. C. Densité de signal MS2, représentant l’ARN pré-mature et mature.
Quatrième partie
Discussion et perspectives
141
6.6. Association RNAPII – snRNP U1 143
6.6 Association RNAPII – snRNP U1
Les résultats présentés démontrent l’association de l’ARN U1 avec la RNAPII. Par immunopré-cipitation anti-RNAPII, U1 est co-immunoprécipité. Cette association ne concerne pas l’ARN U1 seul mais l’ensemble de la snRNP U1. Cette association a également été démontrée par Das et al.
dans des extraits nucléaires de cellules HeLa en présence d’ATP [65]. L’ATP est utilisé pour désen-gager les splicéosomes potentiellement engagés sur les pré-ARNm de l’extrait nucléaire. Leur im-munoprécipitation RNAPII co-immunoprécipite beaucoup de protéines, identifiées par spectro-scopie de masse et Western blot. Ils trouvent, entre autres, les protéines de la snRNP U1, une pro-téine de la snRNP U2 (U2-A’), des propro-téines SR, des propro-téines hnRNP, des facteurs de transcription ou reliés. D’autre part, Tian montrait déjà en 2001 que la protéine U1-70k co-immunoprécipitait la RNAPII [302]. Par deux méthodes différentes, on constate l’association de la snRNP U1 avec la RNAPII. Mes expériences de crosslink et celles de Kameoka confirment également l’existence d’un complexe RNAPII-snRNP U1in vivo [137]. Dans ces expériences, Kameoka utilise un ARN comprenant un site 5’ss pour assembler le splicéosome. Cet ARN comprend un groupe benzo-phénone photoactivable qui permet de coupler de façon covalente les éléments qui s’y associent.
De cette manière, il obtient deux types de complexes, chacun contenant la RNAPII et la snRNP U1 et d’autres facteurs d’épissage et de transcription sans nécessité d’ATP. De plus, mes résul-tats démontrent que cette association a lieu indépendamment de l’état d’activité de la RNAPII puisque la RNAPII utilisée dans mes expériences est transcriptionnellement inactive. On remar-quera d’ailleurs que Das et al. n’ont pas eu de problème à extraire le complexe RNAPII-snRNP U1.
Peut-être en ont-ils perdu au cours de leurs purifications, néanmoins cela signifie que la liaison qui unit la RNAPII à la snRNP U1 est suffisamment forte pour ne pas être perdue dans un protocole d’extraction de RNAPII transcriptionnellement active.